膜表達人PD-1蛋白的穩轉株細胞構建方法技術

本發明專利技術適用于生物技術領域，提供了一種膜表達人PD-1蛋白的穩轉株細胞構建方法。該方法包括以下步驟：載體pLVX-PD-1-IRES-ZsGreen1的構建；病毒包裝；穩轉株細胞的構建。該方法通過包裝慢病毒再感染真核細胞，經流式細胞儀分選后得到可穩定表達PD-1抗原的細胞株，使得其能在單抗研發過程中通過結合表面表達的抗原快速篩選到具有高親和力的單克隆抗體生產株，大量的節約單克隆篩選時間和篩選成本。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，尤其涉及膜表達人ro-1蛋白的穩轉株細胞構建方法。
技術介紹
程序性細胞死亡蛋白1(Programmedcelldeathproteinl，以下簡稱ro-l)是 由H)CD1基因也叫CD279基因編碼的蛋白，為免疫球蛋白超家族中的細胞膜蛋白成員之一， 是典型的由268個氨基酸組成的I型膜蛋白。H)-l是⑶28/CTLA4家族中的T細胞調節因 子之一，其結構包括一個胞外的IgV結構域，其后緊跟著一個跨膜結構域和一個胞內末端。 PD1最初是在凋亡的T細胞雜交瘤中得到的，由于其和細胞凋亡相關而被命名為程序性死 亡-1受體。pd-li與其t細胞上的受體ro-i相互作用，在免疫應答負調控方面發揮著重要 作用，該分子具有廣泛的組織表達譜，在一些腫瘤細胞系上有較高的表達，許多研究均表明 其于腫瘤的免疫逃逸機制相關。腫瘤部位的微環境可誘導腫瘤細胞上的ro-Li的表達，且 廣范表達，表達的ro-Ll有利于腫瘤的發生和生長，誘導抗腫瘤T細胞的凋亡。因此通過阻 斷ro-Li/ro-i信號通路可有效抑制腫瘤生長，可根據此設計新的對腫瘤免疫逃逸的治療 方案，來加強T細胞對腫瘤的殺傷作用。 在抗腫瘤免疫中，通常遵循腫瘤特異性T細胞活化、T細胞增值、腫瘤浸潤和T細 胞記憶應答加強的步驟。研究表明，腫瘤細胞以及腫瘤微環境中的apcs表達的ro-Li均可 經ro-1/PD-Ll信號通路抑制腫瘤抗原特異性T細胞的活化，下調T細胞介導的腫瘤免疫應 答，干預ro-1/PD-Ll信號有望成為腫瘤免疫治療的新策略。 目前，構建穩定表達細胞系有兩種方法： 1)抗生素篩選：該種方法的構建穩定表達細胞系的基本原理是將外源DNA克隆 到具有某種抗性的載體上，將目標基因構建至帶有抗生素篩選標記的質粒上，載體在通 過磷酸鈣轉染、脂質體轉染或者電轉等方式轉染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用 載體所含的抗生素標志進行篩選。最常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素 (neomycin)、潮霉素（hygromycin)和噪呤霉素（puromycin)，用長G418來代替新霉素進行 選擇性篩選，篩選得到可穩定表達的目的蛋白的細胞株。但其篩選時間長，且受限于所采用 的轉染方式和相應的細胞系，對于某些不能轉染長期培養的原代細胞和難轉染的細胞將不 適合采用這種方法，且轉然效率的高低直接影響整合發生的概率，而且假陽性發生率高，細 胞在長期的抗生素培養基中容易產生抗藥性，后續細胞篩選鑒定工作量大。 2)慢病毒感染后篩選：慢病毒（Lentivirus)載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷I型 病毒）為基礎發展起來的基因治療載體，區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分 裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體帶有可進行高效率的包裝、轉染并穩定整合進靶細胞 的基因組中的序列元件，目的基因參與細胞的基因重組，形成穩定遺傳物質，使得目的基因 在細胞中可穩定長期表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、 腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果。慢病毒 感染細胞后能很快將目的基因隨機整合至基因組中，整合效率高，假陽性少等優點。且其篩 選標記物可擴展到各類熒光蛋白標記的非抗生素標記物，如EGFP，RFP，YFP，ZsGreenl等， 在后續的篩選中可輕易通過流式細胞儀進行識別和篩選，無需加入流式抗體。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種膜表達人ro-i蛋白的穩轉株細胞構建方法，旨在解 決現有技術單克隆抗體生產株假陽性發生率高、親和力不高、單克隆篩選時間長和篩選成 本高的問題。 本專利技術是這樣實現的，一種膜表達人ro-i蛋白的穩轉株細胞構建方法，包括如下 步驟： 設計含酶切位點EcoRI的引物pLVX-PD-1-F和含酶切位點BamHI的引物 pLVX-PD-1-R，并所述藥物與ro-1的DNA序列進行PCR擴增，收集擴增產物； 將慢病毒包裝質粒載體pLVX-IRES-ZsGreenl與所述擴增產物分別進行酶切處 理，分別得到pLVX-IRES-ZsGreenl(EcoRI+BamHI)和PD-1 (EcoRI+BamHI)酶切產物；所述 pLVX-IRES-ZsGreenl(EcoRI+BamHI)和PD-1 (EcoRI+BamHI)酶切產物連接后轉化處理，將 轉化產物擴增后進行質粒抽提處理，得到膜表達H)-l的載體pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl; 將所述膜表達PD-1的載體pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl與病毒包裝質粒pMD2. G和 PsPAX2共轉染至真核細胞中，進行病毒包裝，同時對病毒滴度進行監控； 當病毒滴度以M0I=2-10感染所述真核細胞時，加入終濃度為5-8ug/ml的 polybrene協助病毒；將感染病毒的所述真核細胞進行正常傳代后，選取熒光陽性細胞進 行分選，并對分選的細胞進行擴增后凍存處理，得到穩定表達ro-i的細胞株。本專利技術提供 的膜表達人ro-i蛋白的穩轉株細胞構建方法，通過包裝慢病毒再感染真核細胞，經熒光篩 選后得到可穩定表達ro-1抗原的細胞株。由于該方法中將包裝的慢病毒進一步的感染了 真核細胞，使得其能在單抗研發過程中通過結合表面表達的抗原快速篩選到親和力高的 ro-1細胞株；且采用自帶熒光蛋白ZsGreen的載體進而穩轉株的構建，使得在ro-1細胞株 的篩選過程變得更為簡單方便，大量的節約單克隆篩選時間和篩選成本。【附圖說明】 圖1是本專利技術實施例膜表達人ro-1蛋白的穩轉株細胞構建方法流程圖； 圖2本專利技術實施例提供的ro-1的DNA的PCR擴增產物電泳圖，其中，M表示 Marker，"一"表示陰性對照，1-2為ro-1的DNA的PCR產物； 圖3是本專利技術實施例提供的pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl載體構建酶切鑒定電泳 圖，其中，M表示Marker; 1-4 為pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl單克隆EcoRI+BamHI雙酶切； 圖4是本專利技術實施例提供的蛋白表達鑒定中的質粒轉染細胞熒光圖； 圖5是本專利技術實施例提供的WesternBlot蛋白表達圖，其中，1為293T細胞胞液， 2為293T細胞膜抽提液，3為ZsGreen細胞胞液；4為ZsGreen細胞膜抽提液，5為H)-l細 胞胞液；6為ro-i細胞膜抽提液； 圖6是本專利技術實施例提供的病毒包裝時細胞轉染熒光圖； 圖7是本專利技術實施例提供的病毒滴度測定時的病毒感染熒光圖，其中，a為5iU病 毒感染英冠圖，b為0. 5ii1病毒感染突光圖；圖8是本專利技術實施例提供的毒滴度分析流式圖，其中，a為5iU病毒感染孔的毒 滴度分析流式圖，b為0. 5ii1病毒感染孔的毒滴度分析流式圖；圖9是本專利技術實施例提供的穩轉株細胞構建時的病毒感染熒光圖； 圖10是本專利技術實施例提供的穩定表達細胞株分選流式圖。【具體實施方式】 為了使本專利技術要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合 附圖及實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用 以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。 本專利技術實施例提供了一種膜表達人ro-i蛋白的穩轉株細胞構本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種膜表達人PD?1蛋白的穩轉株細胞構建方法，包括如下步驟：設計含酶切位點EcoRI的引物pLVX?PD?1?F和含酶切位點BamHI的引物pLVX?PD?1?R，并所述藥物與PD?1的DNA序列進行PCR擴增，收集擴增產物；將慢病毒包裝質粒載體pLVX?IRES?ZsGreen1與所述擴增產物分別進行酶切處理，分別得到pLVX?IRES?ZsGreen1（EcoRI+BamHI）和PD?1（EcoRI+BamHI）酶切產物；所述pLVX?IRES?ZsGreen1（EcoRI+BamHI）和PD?1（EcoRI+BamHI）酶切產物連接后轉化處理，將轉化產物擴增后進行質粒抽提處理，得到膜表達PD?1的載體pLVX?PD?1?IRES?ZsGreen1；將所述膜表達PD?1的載體pLVX?PD?1?IRES?ZsGreen1與病毒包裝質粒pMD2.G和PsPAX2共轉染至真核細胞中，進行病毒包裝，同時對病毒滴度進行監控；當病毒滴度以MOI=2～10感染所述真核細胞時，加入終濃度為5?8ug/ml的polybrene協助病毒；將感染病毒的所述真核細胞進行正常傳代后，選取熒光陽性（細胞進行分選，并對分選的細胞進行擴增后凍存處理，得到穩定表達PD?1的細胞株。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：萬曉春，劉婕，
申請(專利權)人：深圳先進技術研究院，
類型：發明
國別省市：廣東;44