一種豬腸道干細胞的分離培養方法技術

本發明專利技術屬于細胞分離技術領域，具體公開了一種豬腸道干細胞的分離培養方法；本發明專利技術首先篩選可用于豬腸道干細胞分選的特異性抗體，所述抗體包括CD24、CD44和CD166，所述CD24抗體來源于ML5單克隆；利用該抗體，通過流式細胞技術可針對性的篩選出豬腸道干細胞，通過建立三維的培養體系，可培養出類腸團，本發明專利技術為腸道上皮更新研究和組織特異性干細胞移植提供良好的材料。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及細胞分離
，更具體地，涉及。
技術介紹
腸道干細胞(intestinal stem cells，ISC)旺盛的增殖分化能力，在維持腸粘膜屏障結構和功能的完整性及腸粘膜的損傷修復中起著至關重要的作用。有研宄發現，ISC參與了腸道粘膜增生、分化以及腸道腫瘤的發生發展。豬腸道干細胞可以產生新的細胞以維持豬腸道上皮日常更新和修復豬腸道上皮損傷，因此對于腸道損傷修復、腸道健康和腸道再生醫學具有極大的作用。然而，豬腸道干細胞存在于腸道隱窩中，豬腸道隱窩存在于腸道肌層深處，且腸道干細胞在隱窩中存在的數目非常少。在科學研宄和臨床上應用前，豬腸道干細胞必需先被分離出來，然后通過體外培養增加其細胞數目，現有技術中對于如何獲得足夠數量且活性良好的豬腸道干細胞，并對其進行體外擴大培養的研宄也不斷增多，這些研宄為腸道上皮更新研宄和組織特異性干細胞移植提供良好的理論基礎。關于上述研宄主要集中在豬腸道干細胞的分離和體外培養擴大。目前各種研宄證據表明，腸道干細胞可通過流式細胞技術從腸上皮細胞中分離出來，通過體外三維培養體系進行培養。但是，從新鮮豬腸道中分離腸道干細胞進行體外培養有別于小鼠等其它物種，其主要的困難在于缺乏可用于流式細胞技術的有效抗體和適合分離后豬腸道干細胞的培養體系。因此，目前還沒有關于豬腸道干細胞分離培養的相關報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于填補現有豬腸道干細胞分離技術空白，提供一種通過流式細胞術分離豬腸道干細胞的特異性抗體。本專利技術的第二個目的是提供一種可以有效分離豬腸道干細胞的方法。本專利技術的第三個目的是提供上述豬腸道干細胞的體外擴大培養方法。本專利技術的目的通過以下技術方案予以實現: 一種通過流式細胞術分離豬腸道干細胞的特異性抗體，所述抗體包括CD24、CD44和⑶166，所述⑶24抗體來源于ML5單克隆。腸道干細胞對于腸道損傷修復、腸道健康和腸道再生醫學具有極大的作用，因此獲取腸道干細胞具有重要的指導意義，但是，當前相關研宄的最大障礙是缺乏針對腸道干細胞的抗體，從而嚴重制約了腸道干細胞的分離和體外培養。腸道干細胞表面被不同的蛋白受體所覆蓋，可選自性地結合和黏附其他“信號”分子，由于與“信號”分子的親和力不同，在用流式細胞術分離豬腸道干細胞時，現有技術還沒有針對豬腸道干細胞的特異性抗體。本專利技術在現有技術的基礎上，通過大量的實驗分析研宄，篩選出了特異性針對豬腸道干細胞的抗體，利用該抗體，并結合流式細胞術可以針對性的分離出豬腸道干細胞。優選地，本專利技術所述抗體由⑶24、⑶44及⑶166組成，所述⑶24抗體來源于ML5單克隆。提供一種豬腸道干細胞的分離方法，是將豬腸道隱窩團消化為單個細胞，加入標記的⑶24、⑶44及⑶166抗體，通過流式細胞術分離出豬腸道干細胞，所述⑶24抗體來源于ML5單克隆。具體地，上述分離方法為:用消化液將豬腸道隱窩團消化為單個細胞，將這些細胞過濾以去除組織塊及黏連細胞，加入標記⑶24、⑶44及⑶166三種細胞表面抗體，借助流式細胞技術，分離出豬腸道干細胞，所述CD24抗體來源于ML5單克隆。優選地，所述腸道隱窩團通過以下方法獲得:將清洗過的仔豬小腸剪成小段，低溫條件下在分離液中孵育，去除分離液后用HBSS重懸、混勻獲得；所述分離液為30.0 mMNa2EDTA-2H20 ；5.6mM 葡萄糖；5.3mM KCl ；0.45mM KH2PO4;4.2 mM NaHCO 3；138mM NaCl ；0.34mM Na2HPO4。更優選地，所述仔豬小腸在分離液中孵育的時間為20?40min ;所述低溫為O?8V。更優選的，所述豬腸道隱窩團通過以下方法獲得:取15?30 cm新鮮的仔豬空腸，用HBSS將內容物沖洗干凈，將腸段剪成I?2 cm的小段，在4°C環境下用分離液孵育30min，去除分離液后用HBSS重懸這些空腸片段，上下顛倒搖晃5?lOmin，獲得豬腸道隱窩團。提供豬腸道干細胞的培養方法，是將上述任一種方法分離獲得的豬腸道干細胞在含有血清和細胞因子的培養基進行培養；所述細胞因子包括fct3a、R-spondinl、Y-27632、Noggin、EGF、LY2157299 和 SB202190。優選地，上述豬腸道干細胞的培養方法是:將上述任一種方法分離獲得的豬腸道干細胞與含有血清和細胞因子的培養基及Magtrigel混勻，待混合物凝固后，加入完全培養基進行培養；所述細胞因子包括 fct3a、R-spondinl、Y-27632、Noggin、EGF, LY2157299和SB202190。具體地，所述豬腸道干細胞的培養條件為細胞領域的常規培養；更具體地，所述豬腸道干細胞的培養方法為:將分離到的豬腸道干細胞按1000個細胞/毫升的濃度與Magtrigel混合均勻，以25微升/孔的體積接種于48孔細胞培養板中，每孔加入250微升的完全培養基，培養20天，期間每2天換液I次。專利技術人通過實驗研宄發現，不同的單克隆所產生的⑶24，有些能夠分離出豬腸道干細胞，而有些則不能分離出豬腸道干細胞，本專利技術所述CD24來源于ML5單克隆，該CD24的說明書見網址(http://www.b1legend, com/alexa-fluor-647-ant1-human-cd24-antibody-3364.html)，說明書內容見說明書附圖的圖5。與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果:本專利技術提供一種通過流式細胞術分離豬腸道干細胞的特異性抗體，所述抗體包括⑶24、⑶44和⑶166，所述⑶24抗體來源于ML5單克隆；利用該抗體，通過流式細胞技術可針對性的篩選出豬腸道干細胞，通過建立三維的培養體系，可培養出結構完整、活性高的豬腸道干細胞，通過本專利技術所述特異性抗體和分離方法獲得的豬腸道干細胞為腸道上皮更新研宄和組織特異性干細胞移植提供良好的材料。【附圖說明】圖1為顯微鏡下的豬隱窩細胞團。圖2為流式細胞儀分選結果。圖3 為 CD44+CD241()CD166+細胞二維培養。圖4 為 CD44+CD241()CD166+細胞三維培養。圖5 為 B1Legend anti human CD24 的當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種通過流式細胞術分離豬腸道干細胞的特異性抗體，其特征在于，所述抗體包括CD24、CD44及CD166，所述CD24抗體來源于ML5單克隆。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：黎相廣，王修啟，高春起，嚴會超，傅厚龍，翟振亞，陳明霞，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44