工程化的肉毒神經(jīng)毒素制造技術(shù)

本文公開了肉毒神經(jīng)毒素(BoNT)多肽，所述多肽具有修飾的肉毒桿菌血清型B的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(B-HC)，所述修飾的肉毒桿菌血清型B的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含對應(yīng)于血清型B，菌株1中的置換突變的一個或多個置換突變：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、或它們的組合。特定的突變組合包括E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、或E1191Q和S1199F。還公開了其它置換突變。還公開了分離的修飾的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、嵌合分子、藥物組合物、以及使用它們的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】【專利說明】 相關(guān)申請的交叉引用 根據(jù)35U.S.C. § 119(e)，本申請要求2012年5月30日提交的美國臨時申請?zhí)?61/653, 214的優(yōu)先權(quán)，以引用的方式將其整體內(nèi)容并入本文。 政府支持 本專利技術(shù)是美國國立衛(wèi)生研宄院授予的NCRR RR000168的政府支持下完成的。美國 政府對本專利技術(shù)享有一定的權(quán)利。
本專利技術(shù)涉及針對神經(jīng)肌肉障礙（neuromuscular disorders)的治療 (therapeutics)的領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
肉毒神經(jīng)毒素 （botulinum neurotoxin)是一個細(xì)菌毒素家族，包括七個主要血清 型（BoNT/A-G)1。這些毒素通過阻斷由神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)而發(fā)揮作用，從而使動物和人麻 痹。近年來，BoNT已被廣泛用于治療越來越多的醫(yī)學(xué)病癥：局部注射微量毒素可以在目標(biāo) 區(qū)域削弱神經(jīng)元活性（neuronal activity)，這在許多醫(yī)學(xué)病癥中、以及對于美容目的而言 可能是有益的2' BoNT/A和BoNT/B是僅有的兩種目前經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于人的BoNT2'這些是從細(xì)菌 純化而來、未經(jīng)任何序列修飾（定義為野生型，WT)的毒素。隨著BoNT的應(yīng)用不斷增加，已 報(bào)道了多種限制和副作用。主要限制是在患者中產(chǎn)生中和抗體，這使得隨后的治療無效化 5。終止使用BoNT往往使患者缺少其它有效的治療/減輕其障礙的途徑。抗體應(yīng)答的可能 性與毒素劑量和注射頻率二者直接相關(guān) 5。因此，這種限制主要發(fā)生在涉及相對高劑量毒素 的肌肉痙攣治療中。與此相一致的是，在使用非常低劑量毒素的美容應(yīng)用中尚未觀察到抗 體應(yīng)答 5。 主要的副作用也往往與治療肌肉痙攣、而非美容應(yīng)用相關(guān)。這是因?yàn)楦弊饔弥饕?是由毒素?cái)U(kuò)散至身體其它區(qū)域所致，并且毒素?cái)U(kuò)散的可能性與注射劑量直接相關(guān)。副作用 的范圍從短暫的非嚴(yán)重事件（如眼瞼下垂和復(fù)視）直至危及生命的事件甚至死亡 6人在由 Sidney Wolfe博士于2008年向FDA提交的請求書中，記載了共180例嚴(yán)重不良事件，其中 16人死亡。因此，目前FDA要求在所有BoNT產(chǎn)品上標(biāo)注"黑框警告"，強(qiáng)調(diào)毒素蔓延的風(fēng)險(xiǎn)， 這一要求是在歐盟頒布了類似警告后作出的。 由于中和抗體的產(chǎn)生和毒素?cái)U(kuò)散均與注射劑量直接相關(guān)，降低毒素劑量（同時保 持相同水平的毒素活性）是高度期望的，這意味著必須增強(qiáng)單個毒素分子的效力。此類對 于神經(jīng)元具有改進(jìn)的特異性的修飾BoNT也將減少任何潛在的由于非特異性進(jìn)入其它細(xì)胞 類型而致的脫靶效應(yīng)。 BoNT通過其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合至其特異性受體，從而靶向并進(jìn)入神經(jīng)元，其受 體結(jié)合結(jié)構(gòu)域在文獻(xiàn)中已有明確界定（BoNT-Hc，圖1A，圖IB)1。受體結(jié)合決定BoNT識別 神經(jīng)元的效力和特異性。提高BoNT的受體結(jié)合能力將增強(qiáng)其對于目標(biāo)神經(jīng)元的效力和特 異性。大多數(shù)BoNT的受體已經(jīng)得以識別（圖1C)。作為其受體，BoNT/B、D-C和G共享兩 個同源的突觸小泡蛋白突觸結(jié)合蛋白I和突觸結(jié)合蛋白II(Syt I/II)843,而BoNT/A、E、D 和F使用另一個突觸小泡蛋白SV29，1448。除了蛋白受體以外，所有BoNT還需要脂質(zhì)共受體 (co-receptor)神經(jīng)節(jié)苷脂（圖1D)，其大量位于神經(jīng)元表面 19。在嗤齒動物（以及可能地 在大多數(shù)哺乳動物）中的兩個Syt異形體（isoforms)中，Syt II對BoNT/B的結(jié)合親和力 比Syt I高~10倍，并且也是在運(yùn)動神經(jīng)末梢（BoNT的靶向神經(jīng)元）中表達(dá)的主要異形體 (圖2A)2°' 21。因此，在嚙齒動物（大多數(shù)研宄均對其進(jìn)行）中，認(rèn)為Syt II是運(yùn)動神經(jīng)末 梢中的主要毒素受體，Syt I則是次要毒素受體。 可能存在爭論的是，BoNT對神經(jīng)元已具有很高特異性，是否有可能進(jìn)一步改善其 與神經(jīng)元的結(jié)合？對人而言，答案是"是"，這是因?yàn)樽罱l(fā)現(xiàn)人Syt II對于BoNT/B而言， 作為受體的結(jié)合和功能均大大削弱，這是由于毒素結(jié)合位點(diǎn)中由嚙齒動物（大鼠/小鼠） Syt II發(fā)生了獨(dú)特氨基酸改變13'22。這一改變是在第54位處（小鼠 Syt II序列）由苯丙 氨酸（F)變?yōu)榱涟彼幔↙)(圖2B)。序列比對已經(jīng)揭示了，在整個脊椎動物（包括鴨嘴獸、 魚、嚙齒動物和猴）間，該位置處的苯丙氨酸在Syt I和Syt II中均是高度保守的23。只有 人和黑猩猩的Syt II在這一位置含有亮氨酸。作為這一殘基改變的結(jié)果，相比于小鼠 Syt II，人和黑猩猩的Syt II與B〇NT/B、D-C和G的結(jié)合大幅降低（圖2C)，并且在介導(dǎo)BoNT/B 進(jìn)入方面效率明顯較低（圖2D)。由于人和黑猩猩的Syt I在相同位置處仍然含有苯丙氨 酸，并能結(jié)合BoNT/B、D-C和G(圖2E)，人中的BoNT/B、D-C和G的高親和力受體被限制為 次要受體Syt I。這些發(fā)現(xiàn)為以下臨床觀察提供了解釋：為在患者中達(dá)到相同的療效水平， 與BoNT/A(結(jié)合不同受體）相比，需要劑量大得多的BoNT/B 24'25。這些觀察先前被歸結(jié)于其 它原因（如所使用的制劑中活性神經(jīng)毒素的百分比）。BoNT/B與人Syt II相對于BoNT/B 與其它物種的Syt II的此類結(jié)合差異的近期觀察表明，BoNT/B的不同殘基可能參與和人 Syt II的結(jié)合。因此，對BoNT/B進(jìn)行的預(yù)期將影響與嚙齒動物Syt II的結(jié)合的序列修飾 可能對于BoNT/B與人Syt II的結(jié)合具有不可預(yù)知的影響。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的一個方面涉及一種肉毒神經(jīng)毒素（BoNT)多肽，所述多肽包含蛋白 酶結(jié)構(gòu)域、蛋白酶切割位點(diǎn)、易位結(jié)構(gòu)域（translocation domain)和修飾的肉毒桿菌 (Clostridial botulinum)血清型B的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（B-Hc)，所述修飾的肉毒桿菌血清型 B的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含對應(yīng)于血清型B，菌株I (strain 1)中的置換突變的一個或多個置 換突變，所述置換突變選自于以下置換突變所組成的組：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、 E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、以及以上置換突變的組合。在一個實(shí)施 方式中，所述修飾的（B-H。）包含兩個置換突變。在一個實(shí)施方式中，所述兩個置換突變對 應(yīng)于 E1191M 和 S1199L、E1191M 和 S1199Y、E1191M 和 S1199F、E1191Q 和 S1199L、E1191Q 和S1199Y、或E1191Q和S1199F。在一個實(shí)施方式中，所述兩個置換突變對應(yīng)于E1191M和 S1199L。在一個實(shí)施方式中，所述兩個置換突變對應(yīng)于E1191M和S1199Y。在一個實(shí)施方式 中，所述兩個置換突變對應(yīng)于El 191M和SI 199F。在一個實(shí)施方式中，所述兩個置換突變對 應(yīng)于E1191Q和S1199L。在一個實(shí)施方式中，所述兩個置換突變對應(yīng)于E1191Q和S1199Y。 在一個實(shí)施方式中，所述兩個置換突變對應(yīng)于El 191Q和SI 199F。 本專利技術(shù)的另一方面涉及一種肉毒神經(jīng)毒素（BoNT)多肽，所述多肽包含蛋白酶結(jié) 構(gòu)域、蛋白酶切割位點(diǎn)、易位結(jié)構(gòu)域和修飾的肉毒桿菌血清型B的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種肉毒神經(jīng)毒素(BoNT)多肽，所述多肽包含：a)蛋白酶結(jié)構(gòu)域；b)蛋白酶切割位點(diǎn)；c)易位結(jié)構(gòu)域；以及d)修飾的肉毒桿菌血清型B的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(B?HC)，所述修飾的肉毒桿菌血清型B的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含對應(yīng)于血清型B，菌株1中的置換突變的一個或多個置換突變，所述置換突變選自于以下置換突變所組成的組：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、以及以上置換突變的組合。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：董民，彭立勝，波爾·埃里克·古斯塔夫·斯滕馬克，羅尼·佩爾阿爾內(nèi)·伯恩特森，
申請(專利權(quán))人：哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US