類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑及應用制造技術

本發明專利技術公開了一種類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑及應用，屬于類彈性蛋白多肽的醫藥配置品及用途。本發明專利技術所述類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑是由類彈性蛋白多肽風干絮狀固體物質溶于磷酸鹽緩沖液配制成的終濃度為500uM-1000uM的液體制劑；其應用是將該液體制劑填充于胃腸道黏膜下層，類彈性蛋白多肽相變為凝膠狀，使胃腸黏膜層與固有肌層充分的分離。這種填充劑注射后,胃腸道軟組織分離距離顯著增加且分離持續時間延長，而不需多次注射；該軟組織分離制劑具有良好的生物相容性；其可降解特性更消除了異物殘留的擔憂。因此本發明專利技術適用于消化內鏡下治療中軟組織分離，以便切除消化道的病變組織，使操作安全有效。

【技術實現步驟摘要】
類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑及應用
本專利技術涉及類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑及應用，屬于類彈性蛋白多肽的醫藥配置品及用途。技術背景在消化道內窺鏡治療中，內窺鏡下黏膜切除術（EMR）及內窺鏡黏膜下剝離術（ESD）是目前廣泛應用于切除消化道癌前病變與消化道早期腫瘤的標準微創治療手段。它們不僅可以使患者避免外科開腹手術的痛苦，還可以進行剝離后組織回收，進行病理學診斷，指導術后復查及進一步治療，因此逐漸成為治療治療早期消化道腫瘤的首選方法。盡管這種內鏡下治療具有方法簡便、創傷性小，療效可靠的優勢，但是其操作技術難度高，存在著相當比例的穿孔、出血等并發癥，因而要求操作者具有更加熟練的操作技術，限制了其臨床應用的發展和提高。在內鏡治療操作中，有效的黏膜下軟組織分離制劑注射，可使使黏膜下層與固有肌層分離，有效的分離病變組織與正常組織，以便于操作，預防和減少并發癥，已成為提高內鏡下黏膜切除治療安全性的有效措施。但是，傳統的軟組織分離制劑如生理鹽水等，在注射后的維持時間短、重復注射率高，不能有效地減少內鏡治療并發癥的發生率，大大降低了內鏡治療的安全性。因此非常有必要尋找新型理想的軟組織分離制劑以提高內鏡下黏膜切除治療的高效性和安全性。類彈性蛋白多肽(Elastin-likepolypeptides,ELPs)是一種用基因工程方法獲得的蛋白質聚合物，其結構主要由五肽重復序列（Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，即纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-X氨基酸-甘氨酸）構成，來源于彈性蛋白的疏水區域，其中Xaa可以是除脯氨酸以外任一氨基酸。它具有一定的熱敏性，當環境溫度低于類彈性蛋白多肽的轉相溫度時，類彈性蛋白多肽呈液體狀態；而當環境溫度高于轉相溫度時，類彈性蛋白多肽聚集呈凝膠狀。由于類彈性蛋白多肽具有這種特殊性質，加之有良好的組織相容性、非免疫原性，這為其在生物醫學材料方面的研究和利用提供了依據。目前，類彈性蛋白多肽多在組織工程上應用。其水凝膠體已成功應用于軟骨、椎骨的組織修復、血管的移植、膀胱干細胞基體神經引導干細胞薄片及手術后的傷口愈合。另外，其在靶向腫瘤和構造藥物載體微粒方面也取得了一定的研究進展。
技術實現思路
本專利技術就是為了解決現有技術中，傳統的軟組織分離制劑在注射后的維持時間短、重復注射率高，不能有效地減少內鏡治療并發癥的發生率，提高內鏡治療的安全性等問題，而提供一種以類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑及應用。本專利技術是按照以下技術方案實現的。一種類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑，將類彈性蛋白多肽風干絮狀固體物質溶于磷酸鹽緩沖液制成的終濃度為500uM-1000uM的液體制劑，尤其是濃度為500uM。類彈性蛋白多肽分子量為50kD，純度為大于99%。本專利技術所述的類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑具有溫敏特性，當溫度超過其相變溫度37℃時，其可由液態轉化為凝膠狀態。本專利技術所述的類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑的使用量為單次注射5-10ml。一種類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑的應用，其是將類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑填充于胃腸道黏膜下層，類彈性蛋白多肽相變為凝膠狀，使胃腸黏膜與固有肌層充分分離。使用時，利用消化內鏡進鏡，到達操作部位，在內鏡下通過注射針，于黏膜下層注射類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑，待黏膜與固有肌層充分分離，進行病變黏膜剝離切除。本專利技術的有益效果是：在內鏡治療操作中，應用類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑注射于胃腸道黏膜下層，使黏膜與固有肌層充分的分離，以利于完全切除病變組織。該軟組織分離制劑在體溫下，由注射時的液相流動狀態變相為類凝膠狀態，使注射后的軟組織分離距離顯著增加，且保留時間延長，而不需多次注射，為手術提供良好視野和操作空間，從而提高成功率和減少手術時間，大大減低了內鏡治療并發癥如穿孔、出血的發生；該軟組織分離制劑具有良好的生物相容性，無毒副作用；其可降解特性更消除了異物殘留的擔憂。由于本專利技術適用于消化內鏡下治療中的軟組織分離，以便切除病變組織，使操作更安全有效。附圖說明圖1是不同黏膜下注射劑對SD大鼠胃黏膜厚度隨時間變化的影響；圖2是每一時間點各組間黏膜厚度變化的對比圖；圖3是30min時不同注射液維持黏膜厚度的組織學表現；圖4是黏膜切除后20min出血量對比圖；圖5是注射ELPs內鏡下黏膜剝離術標記圖；圖6是黏膜下注射ELP后黏膜的隆起；圖7黏膜剝離邊緣圖；圖8是黏膜切除圖；圖9是黏膜剝離形成的人工潰瘍圖；圖10是黏膜剝離術后人工潰瘍2周圖；圖11是黏膜剝離術后人工潰瘍4周圖；圖12是黏膜剝離術后潰瘍愈合圖。具體實施方式下面結合附圖及實施例對本專利技術進行詳細的說明。本專利技術所述的類彈性蛋白多肽為ELP120-Tyr7,含有7個酪氨酸，其分子量為50KDa，純度為大于99%，應用濃度為500uM，相變溫度為37℃(500uM)。一.類彈性蛋白多肽的制備1.類彈性蛋白多肽的制備方法：①將表達類彈性蛋白多肽的載體轉入到大腸桿菌表達菌株中；②含有pET-22b-ELPs重組質粒的BL21工程菌按1∶100的接種量接種到含100μg/mL氨芐青霉素的TB培養基中(每升TB培養基中含12g蛋白胨，24g酵母浸提物，2.31g磷酸氫二鉀，12.54g磷酸二氫鉀，4mL甘油)，37℃下250r/min培養24h；③在4℃，4000r/min離心15min，收獲菌體，用預冷的PBS緩沖液(137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，4.2mmol/LNaH2PO4，1.4mmol/LKH2PO4，pH為7.3)重懸菌體，然后置冰浴中超聲破碎(超聲2s，間隔3s，共5min)；④類彈性蛋白多肽s純化采用可逆相變循環(Inversetransitioncycling，ITC)，即在大腸桿菌破碎液，向其加入聚乙烯亞胺(終濃度為0.5％)以去除核酸；4℃，13000r/min離心15min，取上清；向上清液中添加NaCl至終濃度為2mol/L，37℃水浴15min后，13000r/min，離心15min去上清向沉淀中加入預冷的PBS溶解沉淀，冰浴15min后，4℃、13000r/min，離心15min；向上清液中再添加NaCl至終濃度為2mol/L，37℃水浴15min后，13000r/min，離心15min去上清；向沉淀中加入預冷的PBS溶解沉淀，冰浴15min，4℃、13000r/min，離心15min，收集上清液，以上過程為兩輪ITC。2.類彈性蛋白多肽純度和分子量測定：聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測類彈性蛋白多肽純度。應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI–MS）方法檢測的類彈性蛋白多肽分子量。3.類彈性蛋白多肽相變溫度測定：測定類彈性蛋白多肽相變溫度（Athermallyresponsivebiopolymerforintra-articulardrugdelivery.JournalofControlledRelease2006,115:175–182），即：測定10℃到95℃類彈性蛋白多肽s的PBS溶液，在波長為350nm處，類彈性蛋白多肽溶液的濃度用溫度控制的UV-Vis分光光度計測定，升溫速率為1℃/min。相變溫度定義為在OD350本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種類彈性蛋白多肽制備的軟組織分離制劑，其特征在于：將類彈性蛋白多肽風干絮狀固體物質溶于磷酸鹽緩沖液配制成的終濃度為500uM?1000uM的液體制劑。

【技術特征摘要】
2014.03.03 CN 20141007425291.一種類彈性蛋白多肽在制備軟組織分離制劑中的應用，其是將類彈性蛋白多...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉文天，劉文革，王邦茂，鄭忠青，王濤，趙明星，張續乾，荊洋，
申請(專利權)人：天津醫科大學總醫院，
類型：發明
國別省市：天津;12