一種融合蛋白及其制備和應用制造技術

本發明專利技術公開了一種融合蛋白及其制備和應用。該融合蛋白為SEQNO.2所示序列，該融合蛋白由滯育關聯蛋白3基因與載體連接后，得到的重組質粒轉染大腸桿菌感受態細胞并誘導蛋白表達得到。本發明專利技術生產的DAP-3融合蛋白具有較高的SOD活性，能夠作為超氧化物歧化酶使用，在抗氧化，延緩衰老，提高免疫力等方面的功效使得其在藥品，化妝品的開發方面具有極大的潛力。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及融合蛋白的
，具體涉及。
技術介紹
-、SOD制品的應用 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase)簡稱S0D，是一種廣泛存在于自然界的生物 酶，按所含金屬種類不同可分為銅鋅S0D、錳SOD和鐵SOD三種?，F在市場上出售的SOD大 多都從血液中提取，屬銅鋅SOD (Cu/Zn-SOD)。Cu/Zn-SOD分子由兩個亞基組成，每個亞基 含有一個銅離子和一個鋅離子，分子量在32000左右。SOD是一種生物酶，其化學本質是蛋 白質，國內外對其毒性進行了廣泛的研究。實驗表明，它對人體無毒副作用，是一種純天然 的生物活性物質。 由于SOD是一種特殊的生物酶，因此具有許多特殊的功能，目前國內外應用主要 集中在以下幾方面： 1、作為藥用酶原料 研究表明，機體內由各種原因產生的過量自由基，尤其是超氧陰離子自由基（02-)，它 與很多疾病如炎癥、放射病、自身免疫性疾病、腫瘤及衰老等有關，而SOD是體內氧自由基 的專一清除劑，因此，它在治療自身免疫性疾病(如類風濕性關節炎、肺氣腫、紅斑狼瘡等)、 放射治療、心血管疾病、延緩機體衰老等方面有明顯的作用。作為藥用酶，牛血SOD在美國、 德國、澳大利亞等國家已經有產品，商品名分別為0rgotein、0rmetein、0ntosein、Palosein 和Paroxinorm等。在我國，豬日血來源肌注SOD也已經通過衛生部的新藥評審。 2、作為化妝品的添加劑 根據衰老自由基學說，老化是由自由基的產生和清除功能發生障礙造成的結果。在正 常情況下，自由基的產生與清除處于平衡狀態，但隨著機體的衰老和外界因素的影響，這種 平衡往往會被打破，多余的自由基就能通過多種渠道損傷機體。例如氧自由基能引起脂質 過氧化。過氧化脂質會同蛋白質交聯，產生不溶性蛋白質。這種變化以結締組織中膠原蛋 白最為明顯，它能導致膠原變韌、長度縮短，使皮膚失去膨脹力，產生皺紋。此外，過氧化脂 質在氧化酶的作用下能分解產生丙二醛等化學物質，在體內迅速同磷脂酰乙醇胺交聯生成 黃色色素，然后再與蛋白質、核酸、脂質等結合生成無生理活性的棕褐色的色素，即所謂老 年斑。經臨床驗證和長期使用表明，超氧化物歧化酶（SOD)是氧自由基的克星，它不僅能抗 皺、祛斑、去色素，還有抗炎、防曬、延緩皮膚衰老等作用。我國還將SOD添加到牙膏中，使牙 膏具有更強烈的消炎作用，用來治療牙周炎等口腔炎癥。 3、作為功能食品的強化劑 當SOD被證實口服有效后，世界各國爭相開發SOD 口服產品。SOD保健品之所以能在眾 多的保健品中異軍突起，獨占鰲頭，主要是因為它具有以下幾個功效： (1)增強免疫功能抗疲勞 SOD有明顯增強免疫功能的功效。實驗表明，SOD還有改善缺氧和增強耐疲勞的能力， 具有抗疲勞的效果。 (2)延年益壽抗衰老 服用天然超氧化物歧化酶（SOD)可以顯著提高腺細胞中的SOD含量，具有確切的抗衰 老作用。 (3)治病防病有功效 SOD是氧自由基的克星，它能治療由氧自由基引起的多種疾病。實驗表明，它對胃腸道 功能失調、食欲不振、失眠、記憶力衰退、改善心血管功能，均有明顯的防治作用。有人把它 的功能歸之為"一清四抗"--清即有效清除體內多余的氧自由基(體內垃圾)，"四抗"即 抗衰老、抗疾病?？馆椛浜涂蛊凇Ｄ壳皣鴥韧庹龔V泛應用在奶制品、糖果、果汁、飲料、啤 酒和保健膠囊(片劑）等中間。作為保健食品的特殊添加劑，SOD有著廣泛的應用前景。 二、大腸桿菌表達系統 大腸桿菌表達系統是基因表達技術中發展最早，目前應用最廣泛的經典表達系統。與 其它表達系統相比，大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚，目的基因表達水平高，培養周期 短，抗污染能力強等特點。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是：一是現有技術SOD生產過程中從動物血液當中提取 的問題，包括動物血液的采集過程復雜，提取出來的組分不單一等問題；二是采取原核表達 系統來獲得SOD產物，在確?；钚詻]有喪失的情況下，避免了真核表達系統復雜，表達量相 對較低，純化困難的問題。 為了解決上述技術問題，本專利技術提供了一種利用大腸桿菌表達系統高效表達柞蠶 dap-3基因得到的融合蛋白，該融合蛋白純度高且具有很高的SOD活性。 本專利技術提供一種融合蛋白，該融合蛋白為SEQ NO. 2所示序列，該融合蛋白由滯育 關聯蛋白3基因與載體連接后，得到的重組質粒轉染大腸桿菌感受態細胞并誘導蛋白表達 得到。 優選地，所述滯育關聯蛋白3基因從柞蠶中獲得，其為SEQ NO. 1所示序列；所述載 體為pET28a ;所述重組質粒為pET28a-i/a/7-3。 優選地，所述大腸感受態細胞為BL21大腸桿菌感受態細胞。 本專利技術提供上述的融合蛋白的制備方法，包括如下步驟： a、 將滯育關聯蛋白3基因與載體連接，得重組質粒； b、 將步驟a得到的重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選，得到含有所述重組質粒 的菌群； c、 步驟b得到的含有所述重組質粒的菌群誘導蛋白表達，得到融合蛋白。 優選地，所述滯育關聯蛋白3基因從柞蠶中獲得，其為SEQ NO. 1所示序列；所述載 體為pET28a ;所述重組質粒為pET28a-i/a/7-3。 優選地，步驟a以柞蠶為材料，由RT-PCR擴增的方法獲得滯育關聯蛋白3基因，通 過設計引物添加酶切位點及聖7 I和III，將pET28a與滯育關聯蛋白3基因連接，構建 成重組質粒pET28a-￡/a/?-3。 優選地，所述大腸感受態細胞為BL21大腸桿菌感受態細胞。 優選地，步驟c為將步驟b得到的含有所述重組質粒的菌群接種培養基并加入誘 導劑，誘導蛋白表達，超聲，純化后得到融合蛋白。 本專利技術提供上述融合蛋白作為超氧化物歧化酶的應用。 本專利技術提供一種超氧化物歧化酶，其為上述融合蛋白。 本專利技術能夠到達以下技術效果： 本專利技術利用大腸桿菌表達系統，將柞蠶DAP3大量表達，既能獲得高活性的SOD制品，又 能降低成本，可規?；a，以適應市場需求，其操作流程簡單，生產周期短，基因來源方便 快捷，符合低碳經濟理念，能結合產業化生產以滿足市場的需要，有較為廣闊的市場前景。 本專利技術生產的DAP-3融合蛋白具有較高的SOD活性，在抗氧化，延緩衰老，提高免疫力等方 面的功效使得其在藥品，化妝品的開發方面具有極大的潛力。【附圖說明】 圖1是本專利技術的RT-PCR獲得dap-3基因的PCR產物電泳圖；其中，M:核酸分子量 標準；1 :目的基因 PCR產物； 圖2是本專利技術重組表達載體pET-28a-dap-3鑒定圖，其中M:核酸分子量標準；I :PCR 鑒定；2 :雙酶切鑒定； 圖3是本專利技術的融合蛋白表達及純化圖；M :蛋白分子量標準；I: pET-28a空載誘導；2: pET-28a-dap-3未誘導；3 :pET-28a-dap-3誘導；4 :超聲后上清；5 :超聲后沉淀；6 :鎳柱純 化。其中箭頭所指示位置為目的蛋白。 圖4是本專利技術融合蛋白純化后SOD活性的測定圖?！揪唧w實施方式】 下面結合附圖和具體實施例對本專利技術作進一步說明，以使本領域的技術人員可以 更好的理解本專利技術并能予以實施，但所舉實施例不作為對本專利技術的限定。 柞蠶體內DAP-3蛋白SOD活性 利用蛋白質分析系統（Exper本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白為SEQ?NO.2所示序列，該融合蛋白由滯育關聯蛋白3基因與載體連接后，得到的重組質粒轉染大腸桿菌感受態細胞并誘導蛋白表達得到。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張耀洲，畢臻樂，楊曉麗，譚淑敏，舒特俊，陳劍清，
申請(專利權)人：天津耀宇生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：天津;12