用于制備安絲菌素的方法技術

一種大規模發酵高產安絲菌素的菌株的工藝。一種用于分離粗安絲菌素的方法。一種用于純化安絲菌素的方法。

【技術實現步驟摘要】
【專利說明】 本申請是申請日為2005年12月12日和專利技術名稱為"" 的200580046871. 6號專利技術專利申請的分案申請。
本專利技術涉及用于制備安絲菌素的工藝。安絲菌素是指具有不同的C-3酯側鏈的安 絲菌素的混合物。安絲菌素能轉變成C-3美登木醇（maytansinol)。
技術介紹
安絲菌素是微生物比如珍貴橙色束絲放線菌（Actinosynnema pretiosum)發 酵產生的高細胞毒性的化合物。安絲菌素已被化學轉變成含硫醇的美登木素生物堿 (maytansinoids)，該生物堿以細胞結合劑-美登木素生物堿偶聯物的形式體現出的醫療 用途已經被報道（美國專利Nos. 5, 208, 020、5, 416, 064、6, 333, 410、以及6, 441，163)。 用束絲放線菌（Actinosynnemaspp)菌株如珍貴橙色束絲放線菌的發酵工藝制備 多個在C-3處具有不同的酯取代基的安絲菌素品種（圖1)。制備的各種C-3酯包括P-3 (異 丁酰）、P_3'（正丁酰）、P_2(丙酰）、P-4(異戊酰）、P-4'（正戊酰）。所有這些酯均可以 被還原分解成C-3美登木醇（P-0)，該醇是用于合成含硫醇美登木素生物堿的前體。此外， 還生成了少量的不希望有的安絲菌素，該安絲菌素在其他位置例如N-脫甲基、20-0-脫甲 基以及19-脫氯處被修飾。在還原性脫酰作用下，這些安絲菌素不生成美登木醇。 通過發酵束絲放線菌制備安絲菌素的工藝已經被報道（美國專利 Nos. 4, 162, 940、4, 450, 234、4, 228, 239、4, 331，598 以及 4, 356, 265)。安絲菌素的產量一般 在12mg/L~100mg/L范圍內隨滴度而變化。典型地，通過多步驟工藝來回收并提純安絲菌 素，該工藝包括向整個發酵培養液中添加助濾劑和有機溶劑，接著用石油醚濃縮有機層和 沉淀物。用硅層析和析晶進一步提純沉淀物，接著通過重結晶或層析進一步純化。 因此，該工藝是繁瑣的，并且包括多個其中劇毒材料必須被處理的步驟。于是，采 用這種工藝進行大規模生產非常困難。此外，在各個工藝步驟中還必須確保操作人員的安 全。 最近的申請（US2002/0015984A1)要求保護用于安絲菌素制備工藝中的改進技 術。據報道，在發酵培養液中的安絲菌素的滴度是65~86mg/L。要求保護的改進技術包括 使培養液在75°C下熱滅活、萃取到芳香烴溶劑比如甲苯中、通過開口硅柱層析、以及析晶。 為降低制備安絲菌素的成本，已經培養了新的束絲放線菌菌株，其比先前描述的那些菌株 具有顯著提高的滴度（在發酵器中高達400mg/L)。先前描述的用于制備安絲菌素的工藝有 幾個缺點，從而不適用于新開發的高產菌株。例如，培養液在75°C下熱滅活導致安絲菌素發 生部分降解，從而損失10%~20%的產量。用芳香烴萃取包含較高含量安絲菌素的發酵培 養液效率低且不完全，這是因為安絲菌素在這種溶劑中的溶解度不高。在開口的自填充硅 柱（self-packedsilicacolumn)上純化安絲菌素有兩個缺點：1)在純化和回收中的批次 變化，以及2)較高的人員暴露風險所產生的安全問題。因此，目前需要高產量地制備安絲 菌素，并提供一種用于高效率分離和純化安絲菌素的工藝，同時最小化工人暴露于高毒性 藥物的幾率。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是提供一種用于大規模發酵產安絲菌素的微生物的工藝，該工 藝尤其適用于新的能高產安絲菌素的菌株。 本專利技術的另一目的是提供一種用于分離粗安絲菌素和用于制備精制安絲菌素的 方法，包括如下步驟： 1)任選的使培養液失活，例如將培養液加熱到約50~55°C或添加1 %體積的氯 仿，2)用非芳香族有機溶劑萃取，3)濃縮萃取物，4)在硅柱或氧化鋁柱上，優選在預填充硅 筒柱柱（pre-packedsilicacartridgecolumn)上純化濃縮物，以及5)產物的析晶。 本專利技術的其他目的包括如下內容： 一種用于制備精制安絲菌素的工藝，其包括如下步驟： 1)在液體培養基中培養產安絲菌素的微生物； 2)用不相溶于水的非芳香族溶劑從培養基中萃取安絲菌素； 3)濃縮萃取的安絲菌素；以及4)通過a)、b)、c)和d)中的任何一個來純化安絲菌素：a)在硅膠或氧化鋁上吸附層析， b)析晶，c)先在硅膠或氧化鋁上吸附層析，然后析晶，以及 d)先析晶，然后在硅膠或氧化鋁上吸附層析。 一種用于制備精制安絲菌素的工藝，其包括如下步驟： 1)在液體培養基中培養產安絲菌素的微生物； 2)用不相溶于水的非芳香族溶劑從培養基中萃取安絲菌素；3)濃縮萃取的安絲菌素；以及 4)通過a)、b)、c)和d)中的任何一個來純化安絲菌素：a)在硅膠或氧化鋁上吸附層析，b)析晶，c)先在硅膠或氧化鋁上吸附層析，然后析晶，以及d)先析晶，然后在硅膠或氧化鋁上吸附層析。 一種用于制備精制安絲菌素的工藝，其包括如下步驟：1)在液體培養基中培養產安絲菌素的微生物； 2)用不相溶于水的非芳香族溶劑從培養基中萃取安絲菌素； 3)濃縮萃取的安絲菌素；以及 4)通過先在硅膠或氧化鋁上吸附層析，然后析晶來純化安絲菌素。 一種用于制備精制安絲菌素的工藝，其包括如下步驟：1)在液體培養基中培養產安絲菌素的微生物；2)用不相溶于水的非芳香族溶劑從培養基中萃取安絲菌素； 3)過濾以除去固體，從而允許有機相分離； 4)從有機相中濃縮安絲菌素；以及5)通過a)、b)、c)和d)中的任何一個來純化安絲菌素： a)在硅膠或氧化鋁上吸附層析， b)析晶， c)先在硅膠或氧化鋁上吸附層析，然后析晶，以及 d)先析晶，然后在硅膠或氧化鋁上吸附層析。 一種用于制備精制安絲菌素的工藝，其包括如下步驟： 1)在液體培養基中培養產安絲菌素的微生物； 2)采用各種離心技術，用不相溶于水的非芳香族溶劑從培養基中萃取安絲菌素； 3)濃縮萃取的安絲菌素；以及4)通過a)、b)、c)和d)中的任何一個來純化安絲菌素： a)在硅膠或氧化鋁上吸附層析， b)析晶， c)先在硅膠或氧化鋁上吸附層析，然后析晶，以及 d)先析晶，然后在硅膠或氧化鋁上吸附層析。 一種用于制備精制安絲菌素的工藝，其包括如下步驟： 1)在液體培養基中產制備安絲菌素的微生物； 2)在有一種或多種水溶性有機溶劑存在的情況下，將培養液離心以除去固體，同 時在溶液中保留安絲菌素。3)添加不相溶于水的非芳香族溶劑，從而允許將安絲菌素萃取至有機層中。在萃 取過程中，還可以視需要任選地向有機相中添加各種鹽或其他組分。4)濃縮萃取的安絲菌素；以及5)通過a)、b)、c)和d)中的任何一個來純化安絲菌素：a)在硅膠或氧化鋁上吸附層析，b)析晶，c)先在硅膠或氧化鋁上吸附層析，然后析晶，以及d)先析晶，然后在硅膠或氧化鋁上吸附層析。 -種用于制備精制安絲菌素的工藝，其包括如下步驟：1)在液體培養基中培養產安絲菌素的微生物；2)任選地處理培養基以促進安絲菌素的萃取；3)從培養基中將安絲菌素固相萃取到樹脂上；4)使用一種或多種有機溶劑，或者使用一種或多種含水的有機溶劑，從樹脂中等 度洗脫或梯度洗脫安絲菌素；5)濃縮萃取的安絲菌素；以及6)任選地通過a)、b)、c)和d)本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于制備精制安絲菌素的工藝，其包括如下步驟：1)在液體培養基中培養產安絲菌素的微生物，其中所述產安絲菌素的微生物是珍貴橙色束絲放線菌ATCC?31565或珍貴橙色束絲放線菌PF4?4(ATCC?PTA?3921)，其中所述培養是在pH?6.5?8的培養基中和15℃?35℃的溫度下，且其中在所述培養期間提供醇類或醛類以促進安絲菌素的C?3酯側鏈的形成；2)通過固相萃取將安絲菌素從培養基中萃取到選自Amberlite?XAD?4、XAD?16、Diaion?HP20、HP21和Sepabeads?SP825、SP850、SP70、SP700的疏水性樹脂上，其中所述萃取在6?7的pH和30℃?45℃的溫度下進行；3)使用有機溶劑或混有水的有機溶劑，從樹脂中等度洗脫或梯度洗脫安絲菌素；4)濃縮經萃取的安絲菌素；以及5)任選通過在硅膠或氧化鋁上吸附層析來純化安絲菌素，其中所述安絲菌素通過溶劑梯度從柱中洗脫，該溶劑梯度初始為乙酸乙酯和己烷的混合物并不斷增加甲醇的量，其中所述安絲菌素具有以下結構：其中R是H、COCH3、COCH2CH3、COCH(CH3)2、COCH2CH2CH3、COCH2CH(CH3)2或COCH2CH2CH2CH3。...

【技術特征摘要】
...

【專利技術屬性】
技術研發人員：辛西亞·郭，格雷厄姆·S·賓，韋恩·C·威德森，
申請(專利權)人：伊繆諾金公司，
類型：發明
國別省市：美國;US