轉基因微藻和其用于口服遞送蛋白質的用途制造技術

本發明專利技術提供了表達至少一種外源生物活性蛋白質的轉基因微藻。該蛋白質表達微藻(protein-expressing?microalgae)被用于向靶生物體口服遞送呈其完整的和有功能的形式的生物活性蛋白質。在藻類中表達的外源蛋白質的特征在于是生物活性的、發揮至少一種對攝入該藻類的受試者具有有益作用的特定活性。特別地，轉基因微藻被用作用于水生或陸生動物保健的動物食物或用作用于人類健康的食物補充劑。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】轉基因微藻和其用于口服遞送蛋白質的用途專利
本專利技術涉及表達外源生物活性蛋白質的轉基因微藻和其用于向動物和人類口服遞送生物活性蛋白質的用途。專利技術背景生物活性蛋白質對于活生物體的細胞功能是必不可少的，并且負責包括代謝過程的催化、通信、防御、移動和運輸的大多數細胞活性。生物活性蛋白質的口服遞送典型是用于兩個主要目的所需的：治療性蛋白質的遞送和對動物包括人類具有營養的或另一種有益作用的蛋白質的遞送。隨著世界范圍內對食物特別地對動物蛋白質增加的需求，加之意識到動物生長的環境影響，需要開發將改進陸生(terrestrial)和水生農場動物(aquaticfarmanimals)的繁殖和體重增加的精細化農業管理工具。用于海洋動物包括魚、甲殼綱動物(crustaceans)和軟體動物(mollusks)的生長的水產養殖的發展尤其重要，因為海洋動物被認為是更健康的蛋白質來源。然而，水產養殖對于生長海洋動物且特別是魚仍然不是完全有效的系統。典型地，魚需要相對長的時間周期以達到可接受的尺寸和重量。此外，許多品種的魚以無效的方式成熟，使得問題可在魚群中發生，導致由于過度緩慢生長、差的形態(對于觀賞魚)等造成的部分群體的損失。此外，在人工水產養殖環境中，水生動物對傳染病更為敏感，并且當疾病確實發生時，疾病可以以高的致死率快速傳遍整個群體。因此對向陸生和水生農場動物施用治療性或營養性蛋白質的途徑存在需求，所述途徑是不昂貴的且不需要費力。向人類口服遞送治療性或營養性蛋白質也是高度可期望的，因為這種施用模式不需要專業人力并且顯著提高患者對處方劑量的依從性。蛋白質的生物活性取決于它的序列和/或構象，該構象在蛋白質到達它的活性靶之前必須被維持。對于成功的口服遞送，蛋白質應該被保護免受化學和酶促降解，這種降解可發生在將蛋白質加工成食物或飼料組合物的過程和通過經由動物胃腸道的遞送過程。除此之外，蛋白質應該克服阻止進入動物或接近靶目的地的結構障礙。微藻類(單細胞藻類或浮游植物)代表地球上最大的、但是最缺乏了解的微生物界。如同植物對于陸生動物，微藻代表水生食物鏈中所有植物營養素的天然營養基礎和主要來源。已經報道了藻類中重組蛋白質的表達，并且多種方法可用于在藻類細胞中尤其是在細胞質體中產生外源蛋白質。國際(PCT)申請公布號WO2011/063284公開了在光合生物體包括原核生物如藍藻細菌和真核生物如藻類和植物中表達治療性蛋白質的方法。真核生物轉化優選地進入質體基因組，典型地進入葉綠體基因組。此申請公開了藻類細胞中特定治療性蛋白質的表達。已經做出多種嘗試以使用微藻作為用于蛋白質的遞送工具。例如，國際(PCT)申請公布號WO01/98335公開了用于向宿主動物遞送生物活性蛋白質的遞送系統和方法。提供的系統和方法包括獲得被表達載體轉化的藻類細胞，所述表達載體包括可操作地連接到啟動子的編碼生物活性蛋白質的核苷酸序列。在一個闡述的實施方案中，生物活性蛋白質是抗原表位并且向動物施用后藻類細胞誘導宿主動物體內的免疫應答。國際(PCT)申請公布號WO2002/076391公開了微生物細胞的用途，該微生物細胞用作水產養殖和農業中的飼料成分，并且該微生物細胞還包括外源肽、蛋白質、和/或抗體，其將傳遞對病毒或細菌病原體的耐受性或免疫力或以其他方式改善攝入所述微生物細胞的物種的健康和表現。微生物細胞可以是酵母、真菌、細菌或藻類。蛋白質和/或抗體可通過微生物自身的直接遺傳修飾或通過使用已被改變以表達感興趣蛋白質的病毒感染微生物，在微生物細胞內表達。國際(PCT)申請公布號WO2008/027235公開了用于水生動物中疾病或紊亂的預防、改善或治療的方法，該方法通過使用遺傳修飾的微藻直接地或間接地飼養水生動物，該微藻表達特異性靶向感染水生動物的病原體的一種或更多種關鍵表位的重組分子。美國專利申請公布號2011/0014708公開了在藻類中生產外來的期望的基因產物的方法和包含轉基因藻類或它的后代的飼料組合物，該方法包括使用蛋白質酶溶液弱化或移除藻類細胞壁以促進基因轉化。本專利技術還提供了用于在藻類中表達牛乳鐵蛋白(LFB)的修飾的核酸。然而，對易于生產和使用、維持蛋白質的生物活性并且改善生物活性蛋白質的全身吸收的口服遞送系統仍然有未滿足的需求并且具有所述口服遞送系統將是高度有益的。專利技術概述本專利技術提供了用于向生物體口服遞送生物活性蛋白質的基于藻類的平臺，提供呈其活性形式的生物活性蛋白質的全身性吸收。特別地，本專利技術提供了在預定的亞細胞區室中表達至少一種外源蛋白質的轉基因微藻。蛋白質表達微藻(protein-expressingmicroalgae)被用作適用于飼養水生動物和陸生動物的動物食物或食物添加劑以及適用于人類的食物補充劑。外源蛋白質的特征在于是生物活性的、發揮至少一種對靶生物體具有有益作用的特定活性。本專利技術部分地基于以下的意外發現：當藻類被水生動物(包括魚和甲殼綱動物)以及被陸生動物(包括小鼠和家禽)口服攝入時，表達的蛋白質保持活性并且發揮其具有有益作用的特定活性。典型地，蛋白質保持呈其完整形式。不希望受任何特殊的理論或作用機制約束，保持的蛋白質活性可歸因于其位于完整的微藻中，使得微藻細胞作為保護蛋白質免受在動物的胃腸道和/或酸性的胃中的降解的天然包裝材料。根據本專利技術的某些典型的實施方案，蛋白質在微藻的亞細胞區室中，尤其是在液泡中表達。因此，根據一方面，本專利技術提供了包括包含編碼生物活性外源蛋白質的至少一種可轉錄的多核苷酸的表達盒的轉基因真核微藻，其中生物活性外源蛋白質在微藻細胞的亞細胞區室中表達。蛋白質在其中表達的亞細胞區室取決于微藻的種類、表達的蛋白質的類型和將要飼養的動物種類。根據某些實施方案，亞細胞區室選自由液泡、內質網、高爾基系統、溶酶體和過氧化物酶體組成的組。每一種可能性代表了本專利技術的單獨實施方案。根據某些示例性實施方案，外源蛋白質在微藻細胞的液泡中表達。根據這些實施方案，表達盒還包括編碼液泡靶向肽(vacuoletargetingpeptide)的多核苷酸。根據一些實施方案，將外源蛋白質靶向液泡中的肽是具有SEQIDNO:4中列出的氨基酸序列的短的液泡前導序列。根據其他實施方案，編碼短的液泡前導肽的多核苷酸包括SEQIDNO:18中列出的核酸序列。根據某些其他示例性實施方案，外源蛋白質在微藻細胞的內質網(ER)中表達。根據這些實施方案，表達盒還包括編碼ER靶向肽(ERtargetingpeptide)的多核苷酸。根據一些實施方案，將外源蛋白質靶向ER中的肽是具有SEQIDNO:2中列出的氨基酸序列的三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)內質網(Bip)前導序列。根據其他實施方案，編碼ER前導肽的多核苷酸包括SEQIDNO:16中列出的核酸序列。根據本專利技術的教導可使用各種微藻種類。根據某些實施方案，根據本專利技術的教導使用的微藻是海洋微藻。根據某些實施方案，微藻選自但不限于由以下組成的組：三角褐指藻；杜氏藻屬(Dunaliellaspp.)；微擬球藻屬(Nannochloropsisspp.)包括眼點擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata)、鹽生微擬球藻(Nannochloropsissalina)、海洋富油微本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種轉基因真核微藻，所述轉基因真核微藻包括包含編碼生物活性外源蛋白質的至少一種可轉錄的多核苷酸的表達盒，其中所述生物活性外源蛋白質在所述微藻細胞的亞細胞區室中表達。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.08.23 US 61/692,240;2013.03.14 US 61/781,1031.一種轉基因真核微藻，所述轉基因真核微藻包括包含編碼生物活性外源蛋白質的至少一種可轉錄的多核苷酸的表達盒，其中所述表達盒還包括核酸序列為SEQIDNO:18所示的多核苷酸，所述核酸序列為SEQIDNO:18所示的多核苷酸編碼氨基酸序列為SEQIDNO:4所示的功能性液泡靶向肽，并且其中所表達的生物活性外源蛋白質靶向所述轉基因真核微藻的細胞的液泡，并且其中所述轉基因真核微藻選自由以下組成的組：三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、杜氏藻屬(Dunaliellaspp.)、微擬球藻屬(Nannochloropsisspp.)、微綠球藻屬(Nannochlorisspp.)、四爿藻屬(Tetraselmisspp.)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、巴夫藻屬(Pavlovaspp.)、透明繭形藻(Amphiprorahyaline)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)和富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)。2.如權利要求1所述的轉基因真核微藻，其中所述表達盒還包括編碼蛋白結構域的多核苷酸，所述蛋白結構域增強所述生物活性外源蛋白質被異種細胞或組織的攝入。3.如權利要求1所述的轉基因真核微藻，所述轉基因真核微藻是三角褐指藻。4.如權利要求1所述的轉基因真核微藻，其中所述生物活性外源蛋白質具有多達150kDa的分子量。5.如權利要求4所述的轉基因真核微藻，其中所述生物活性外源蛋白質具有治療活性。6.如權利要求4所述的轉基因真核微藻，其中所述生物活性外源蛋白質是激素。7.如權利要求6所述的轉基因真核微藻，其中所述激素選自由生長激素、食欲誘導激素和產卵激素組成的組。8.如權利要求7所述的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：西瑞·摩什茨科，多倫·艾森施塔特，蓋伊·列維，奧芙拉·陳，
申請(專利權)人：特郎薩格以色列有限公司，
類型：發明
國別省市：以色列;IL