本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種利用細菌表面展示系統(tǒng)篩選單鏈抗體的方法。該方法包括如下步驟：A)構(gòu)建由不同待檢測單鏈抗體編碼基因組成的基因編碼庫；用于擴增抗體VH和VL的引物對均為同種屬簡并引物對，用于連接VH和VL的接頭為同種屬CH1；B)獲得特異于所述靶標抗原的所述目標單鏈抗體的基因編碼序列；靶標抗原和待檢測單鏈抗體共表達，并用標簽蛋白Flag標記抗原，借助熒光標記抗標簽蛋白抗體通過流式細胞分選法篩選獲得攜帶有目標單鏈抗體的重組細菌后，通過提取質(zhì)粒重轉(zhuǎn)宿主菌的方法拯救目標單鏈抗體。本發(fā)明專利技術(shù)在傳統(tǒng)的細菌展示技術(shù)的基礎(chǔ)上，做了改進和創(chuàng)新，根據(jù)抗體展示載體所必需的元件和基本原理構(gòu)建了新的抗體細菌展示系統(tǒng)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種利用細菌表面展示系統(tǒng)篩選單鏈抗體的方法。
技術(shù)介紹
細菌展示技術(shù)又稱以細胞內(nèi)膜為基礎(chǔ)的細胞間質(zhì)表達技術(shù)(anchored?periplasma?expression?technology，APEx)。該技術(shù)特點是利用細胞間質(zhì)膜脂蛋白的信號肽NlpA?leader將目的蛋白運送到細菌間質(zhì)腔，而NlpA?leader在蛋白質(zhì)跨膜運輸過程中被逐步降解，剩下的6個氨基酸(CDQSSS)與細胞內(nèi)膜外側(cè)的磷脂層形成脂苷鍵，從而將與其融合的抗體片段展示于細菌內(nèi)膜外側(cè)。當細菌外膜被溶菌酶消化后成原生質(zhì)球，孵育液中的抗原可進入細菌間質(zhì)與錨定在細胞內(nèi)膜外側(cè)的抗體片段結(jié)合，然后將其與熒光標記的抗體進行共孵育，陽性克隆可被流式細胞儀高通量的檢測分離。pelB?leader為果膠酶基因前導肽，可以引導與其融合的蛋白質(zhì)進入細菌間質(zhì)，并且在進入間質(zhì)后也被降解完全。其融合的蛋白質(zhì)在間質(zhì)腔中和牟定的具有結(jié)合能力的抗體片段結(jié)合。細菌展示技術(shù)在篩選抗體方面具有很多優(yōu)勢如：(l)高富集比；(2)高陽性率；(3)由于反應在溶液狀態(tài)下進行，可克服常規(guī)生物淘洗過程中由于篩選配基固定化而導致的“親和效應”。應用流式細胞術(shù)(FCM)進行篩選可以真正的做到實時監(jiān)測同步跟進，非常直觀的追蹤抗原表位的甄別情況。此外，該技術(shù)相對簡便易行，只要經(jīng)過相應的酶切位點就可以直接將抗體片段插入到展示載體中，并且經(jīng)過細菌電轉(zhuǎn)化可獲得庫容量高達109～1010的抗體庫，滿足了抗體篩選對庫容量要求。全世界范圍內(nèi)，只有美國Texas大學于2007年在美國科學院院報上報道了展示Fab抗體庫的展示技術(shù)APEx?2-hybrid，所利用的宿主菌為E.coli?DH10B，但是迄今為止尚無文獻驗證該方法的可行性和實用性。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的一個目的是提供一種獲得特異于靶標抗原的目標單鏈抗體的編碼基因的方法。本專利技術(shù)所提供的獲得特異于靶標抗原的目標單鏈抗體的編碼基因的方法，具體可包括如下步驟：A)按照包括如下步驟的方法構(gòu)建由不同待檢測單鏈抗體編碼基因組成的基因編碼庫：(a1)根據(jù)已知的抗體框架區(qū)序列，設(shè)計并合成用于擴增抗體重鏈可變區(qū)的簡并引物對1，以及用于擴增抗體輕鏈可變區(qū)的簡并引物對2；所述已知的抗體框架區(qū)序列為源自于攜帶所述靶標抗原的微生物的宿主的抗體框架區(qū)序列；如所述靶標抗原為能夠感染人的乙肝病毒的某一蛋白，則所述已知的抗體框架區(qū)序列為人的抗體框架區(qū)序列；(a2)采用所述簡并引物1和所述簡并引物對2從初始樣本中分別擴增得到抗體重鏈可變區(qū)集合和抗體輕鏈可變區(qū)集合；所述初始樣本中含有由不同種抗所述靶標抗原的抗體組成的抗體庫；所述初始樣本可為如下a)或b)：a)健康個體的組織樣本(如血液等)，所述健康個體為免疫了含有所述靶標抗原或其編碼核酸的疫苗后，激起免疫反應產(chǎn)生相應抗體的健康個體；b)患病個體的組織樣品(如血液等)，所述患病個體為因攜帶所述靶標抗原的致病微生物(如病毒、細菌或真菌等)感染所引起的患病個體，且經(jīng)證實已激起免疫反應并產(chǎn)生抗體。所述抗體重鏈可變區(qū)集合為由不同重鏈可變區(qū)組成的集合；所述輕鏈可變區(qū)集合為由不同輕鏈可變區(qū)組成的集合；所述簡并引物對1和所述簡并引物對2均既可為一個引物對，也可為多個引物對。當為多個引物對時，采用所述簡并引物對1中的每個引物對分別對所述初始樣本進行擴增，擴增所得片段的集合即為所述抗體重鏈可變區(qū)集合；采用所述簡并引物對2中的每個引物對分別對所述初始樣本進行擴增，擴增所得片段的集合即為所述抗體輕鏈可變區(qū)集合。(a3)將所述抗體重鏈可變區(qū)集合中的不同重鏈可變區(qū)和所述抗體輕鏈可變區(qū)集合中的不同輕鏈可變區(qū)通過重鏈恒定區(qū)CH1進行隨機連接，獲得由不同待檢測單鏈抗體編碼基因組成的基因編碼庫；所述重鏈恒定區(qū)CH1為源自于攜帶所述靶標抗原的微生物的宿主的重鏈恒定區(qū)CH1的前15個氨基酸；如所述靶標抗原為能夠感染人的乙肝病毒的某一蛋白，則所述重鏈恒定區(qū)CH1為人的重鏈恒定區(qū)CH1的前15個氨基酸；在本專利技術(shù)中，所述抗體重鏈可變區(qū)連接于所述重鏈恒定區(qū)CH1的上游；所述抗體輕鏈可變區(qū)連接于所述重鏈恒定區(qū)CH1的下游。B)按照包括如下步驟的方法獲得特異于所述靶標抗原的所述目標單鏈抗體的基因編碼序列：(b1)將所述基因編碼庫中的各待檢測單鏈抗體編碼基因分別與靶標抗原-標簽蛋白融合基因共同構(gòu)建于同一表達載體，并使所述待檢測單鏈抗體編碼基因融合于信號肽1的編碼基因的下游，使所述靶標抗原-標簽蛋白融合基因融合于信號肽2的編碼基因的下游，獲得重組表達載體庫；所述重組表達載體庫中各載體上均含有所述靶標抗原-標簽蛋白融合基因和任一種所述待檢測單鏈抗體編碼基因；所述靶標抗原-標簽蛋白融合基因為由所述靶標抗原的編碼基因和所述標簽蛋白的編碼基因融合而成的融合基因；所述信號肽1為具有如下功能的信號肽：將與其融合的目的蛋白展示于細菌內(nèi)膜外側(cè)(即將所述與其融合的目的蛋白運送到細菌間質(zhì)腔，并定位于細菌內(nèi)膜外側(cè))；所述信號肽2為具有如下功能的信號肽：將與其融合的目的蛋白運送到細菌間質(zhì)腔后自身完全降解，所述目的蛋白游離于所述細菌間質(zhì)腔內(nèi)；所述信號肽1不具有所述信號肽2的以上功能；且所述信號肽2也不具有所述信號肽1的以上功能。(b2)將所述重組表達載體庫中的各重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主細菌，得到重組細菌庫；所述重組細菌庫中各重組細菌中均含有任一種所述重組表達載體(即在所述重組細菌庫中，每個所述重組細菌中均只含有一種所述重組表達載體，這一種重組表達載體可為所述重組表達載體庫中的任一種所述重組表達載體)；(b3)培養(yǎng)所述重組細菌庫，誘導所述重組表達載體進行表達，由所述待檢測單鏈抗體編碼基因編碼所得的待檢測單鏈抗體被展示于所述細菌內(nèi)膜外側(cè)，由所述靶標抗原-標簽蛋白融合基因編碼所得的靶標抗原-標簽融合蛋白游離于所述細菌間質(zhì)腔內(nèi)；(b4)去除所述重組細菌庫中各重組細菌的外膜(如用溶菌酶處理)，得到原生質(zhì)球庫；所述原生質(zhì)球庫中每個原生質(zhì)球上均展示有任一種所述待檢測單鏈抗體，游離于所述原生質(zhì)球外的所述靶標抗原-標簽融合蛋白能夠被所述待檢測單鏈抗體中的特異性單鏈抗體所捕獲，形成抗原抗體復合物(而所述原生質(zhì)球表面的非特異性單鏈抗體則不能捕獲所述靶標抗原)；(b5)將所述原生質(zhì)球庫與經(jīng)熒光標記的抗所述標簽蛋白的抗體共同孵育，只有表面形成了所述抗原抗體復合物的原生質(zhì)球能夠被標記上所述熒光，從所述原生質(zhì)球庫中獲得表面被標記上了所述熒光的原生質(zhì)球本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種獲得特異于靶標抗原的目標單鏈抗體的編碼基因的方法，包括如下步驟：A)按照包括如下步驟的方法構(gòu)建由不同待檢測單鏈抗體編碼基因組成的基因編碼庫：(a1)根據(jù)已知的抗體框架區(qū)序列，設(shè)計并合成用于擴增抗體重鏈可變區(qū)的簡并引物對1，以及用于擴增抗體輕鏈可變區(qū)的簡并引物對2；所述已知的抗體框架區(qū)序列為源自于攜帶所述靶標抗原的微生物的宿主的抗體框架區(qū)序列；(a2)采用所述簡并引物1和所述簡并引物對2從初始樣本中分別擴增得到抗體重鏈可變區(qū)集合和抗體輕鏈可變區(qū)集合；所述初始樣本中含有由不同種抗所述靶標抗原的抗體組成的抗體庫；所述抗體重鏈可變區(qū)集合為由不同重鏈可變區(qū)組成的集合；所述輕鏈可變區(qū)集合為由不同輕鏈可變區(qū)組成的集合；(a3)將所述抗體重鏈可變區(qū)集合中的不同重鏈可變區(qū)和所述抗體輕鏈可變區(qū)集合中的不同輕鏈可變區(qū)通過重鏈恒定區(qū)CH1進行隨機連接，獲得由不同待檢測單鏈抗體編碼基因組成的基因編碼庫；所述重鏈恒定區(qū)CH1為源自于攜帶所述靶標抗原的微生物的宿主的重鏈恒定區(qū)CH1的前15個氨基酸；B)按照包括如下步驟的方法獲得特異于所述靶標抗原的所述目標單鏈抗體的基因編碼序列：(b1)將所述基因編碼庫中的各待檢測單鏈抗體編碼基因分別與靶標抗原?標簽蛋白融合基因共同構(gòu)建于同一表達載體，并使所述待檢測單鏈抗體編碼基因融合于信號肽1的編碼基因的下游，使所述靶標抗原?標簽蛋白融合基因融合于信號肽2的編碼基因的下游，獲得重組表達載體庫；所述重組表達載體庫中各載體上均含有所述靶標抗原?標簽蛋白融合基因和任一種所述待檢測單鏈抗體編碼基因；所述靶標抗原?標簽蛋白融合基因為由所述靶標抗原的編碼基因和所述標簽蛋白的編碼基因融合而成的融合基因；所述信號肽1為具有如下功能的信號肽：將與其融合的目的蛋白展示于細菌內(nèi)膜外側(cè)；所述信號肽2為具有如下功能的信號肽：將與其融合的目的蛋白運送到細菌間質(zhì)腔后自身完全降解，所述目的蛋白游離于所述細菌間質(zhì)腔內(nèi)；(b2)將所述重組表達載體庫中的各重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主細菌，得到重組細菌庫；所述重組細菌庫中各重組細菌中均含有任一種所述重組表達載體；(b3)培養(yǎng)所述重組細菌庫，誘導所述重組表達載體進行表達，由所述待檢測單鏈抗體編碼基因編碼所得的待檢測單鏈抗體被展示于所述細菌內(nèi)膜外側(cè)，由所述靶標抗原?標簽蛋白融合基因編碼所得的靶標抗原?標簽融合蛋白游離于所述細菌間質(zhì)腔內(nèi)；(b4)去除所述重組細菌庫中各重組細菌的外膜，得到原生質(zhì)球庫；所述原生質(zhì)球庫中各原生質(zhì)球上均展示有任一種所述待檢測單鏈抗體，游離于所述原生質(zhì)球外的所述靶標抗原?標簽融合蛋白能夠被所述待檢測單鏈抗體中的特異性單鏈抗體所捕獲，形成抗原抗體復合物；(b5)將所述原生質(zhì)球庫與經(jīng)熒光標記的抗所述標簽蛋白的抗體共同孵育，只有表面形成了所述抗原抗體復合物的原生質(zhì)球能夠被標記上所述熒光，從所述原生質(zhì)球庫中獲得表面被標記上了所述熒光的原生質(zhì)球，記為熒光?原生質(zhì)球；所述熒光?原生質(zhì)球的表面展示的所述待檢測單鏈抗體即為所述目標單鏈抗體；(b6)從所述熒光?原生質(zhì)球中提取質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)入所述宿主細菌，進行所述質(zhì)粒的擴繁培養(yǎng)，從培養(yǎng)后的細菌中提取所述質(zhì)粒，保種；對所述質(zhì)粒測序后獲得所述目標單鏈抗體的基因編碼序列。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種獲得特異于靶標抗原的目標單鏈抗體的編碼基因的方法，包括如下步驟：
A)按照包括如下步驟的方法構(gòu)建由不同待檢測單鏈抗體編碼基因組成的基因編
碼庫：
(a1)根據(jù)已知的抗體框架區(qū)序列，設(shè)計并合成用于擴增抗體重鏈可變區(qū)的簡并
引物對1，以及用于擴增抗體輕鏈可變區(qū)的簡并引物對2；
所述已知的抗體框架區(qū)序列為源自于攜帶所述靶標抗原的微生物的宿主的抗體
框架區(qū)序列；
(a2)采用所述簡并引物1和所述簡并引物對2從初始樣本中分別擴增得到抗體
重鏈可變區(qū)集合和抗體輕鏈可變區(qū)集合；
所述初始樣本中含有由不同種抗所述靶標抗原的抗體組成的抗體庫；
所述抗體重鏈可變區(qū)集合為由不同重鏈可變區(qū)組成的集合；所述輕鏈可變區(qū)集合
為由不同輕鏈可變區(qū)組成的集合；
(a3)將所述抗體重鏈可變區(qū)集合中的不同重鏈可變區(qū)和所述抗體輕鏈可變區(qū)集
合中的不同輕鏈可變區(qū)通過重鏈恒定區(qū)CH1進行隨機連接，獲得由不同待檢測單鏈抗
體編碼基因組成的基因編碼庫；
所述重鏈恒定區(qū)CH1為源自于攜帶所述靶標抗原的微生物的宿主的重鏈恒定區(qū)
CH1的前15個氨基酸；
B)按照包括如下步驟的方法獲得特異于所述靶標抗原的所述目標單鏈抗體的基
因編碼序列：
(b1)將所述基因編碼庫中的各待檢測單鏈抗體編碼基因分別與靶標抗原-標簽蛋
白融合基因共同構(gòu)建于同一表達載體，并使所述待檢測單鏈抗體編碼基因融合于信號
肽1的編碼基因的下游，使所述靶標抗原-標簽蛋白融合基因融合于信號肽2的編碼基
因的下游，獲得重組表達載體庫；所述重組表達載體庫中各載體上均含有所述靶標抗
原-標簽蛋白融合基因和任一種所述待檢測單鏈抗體編碼基因；
所述靶標抗原-標簽蛋白融合基因為由所述靶標抗原的編碼基因和所述標簽蛋白
的編碼基因融合而成的融合基因；
所述信號肽1為具有如下功能的信號肽：將與其融合的目的蛋白展示于細菌內(nèi)膜
外側(cè)；
所述信號肽2為具有如下功能的信號肽：將與其融合的目的蛋白運送到細菌間質(zhì)
腔后自身完全降解，所述目的蛋白游離于所述細菌間質(zhì)腔內(nèi)；
(b2)將所述重組表達載體庫中的各重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主細菌，得到重組細菌
庫；所述重組細菌庫中各重組細菌中均含有任一種所述重組表達載體；
(b3)培養(yǎng)所述重組細菌庫，誘導所述重組表達載體進行表達，由所述待檢測單
鏈抗體編碼基因編碼所得的待檢測單鏈抗體被展示于所述細菌內(nèi)膜外側(cè)，由所述靶標
抗原-標簽蛋白融合基因編碼所得的靶標抗原-標簽融合蛋白游離于所述細菌間質(zhì)腔
內(nèi)；
(b4)去除所述重組細菌庫中各重組細菌的外膜，得到原生質(zhì)球...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李德山，白銀，徐黎明，
申請(專利權(quán))人：哈爾濱博翱生物醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：黑龍江;23
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