參與花青苷生物合成調(diào)控的MYB轉錄因子制造技術

本發(fā)明專利技術提供一個參與菊花花瓣花青苷生物合成調(diào)控的MYB轉錄因子CmMYB6，其編碼區(qū)序列含765個核苷酸。CmMYB6氨基酸序列中含有保守的R2R3?MYB結構域，并在R3結構域內(nèi)存在一個[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序和一個ANDV基序，前者可與bHLH相互作用，后者為參與花青苷生物合成調(diào)控的MYB轉錄因子的特征基序。CmMYB6的基因表達在花瓣發(fā)育過程中呈上調(diào)趨勢，與花青苷合成呈顯著正相關，可誘導花青苷合成關鍵基因CmDFR啟動子的活性，與MrbHLH1協(xié)同表達時，誘導效能顯著增強，可強烈誘導煙草葉片花青苷的積累。因此，可用于植物花青苷生物合成的轉錄調(diào)控，修飾植株色澤。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于植物分子生物技術和基因工程領域，設及一個參與菊花花瓣花青巧生 物合成轉錄調(diào)控的必陸轉錄因子紐掀公6 (SEQ;N0. 22)。
技術介紹
菊花是我國傳統(tǒng)名花，亦是世界重要花弁之一，為僅次于玫瑰的世界第二大切花。 我國自主培育了近250個切花菊品種，其中單頭切花大菊占切花產(chǎn)量總數(shù)的一半左右。花 色是菊花重要的觀賞性狀之一，單頭切花大菊的花色多W原始色系黃、白為主，除此黃、白 之外，我國自主培育的菊花品種還有綠、青、粉紅、紅、紫和間色等其他色系，多色系的菊花 存在有助于改善切花菊文化的發(fā)揚及其產(chǎn)業(yè)的多元化。 花青巧是眾多紅粉色系菊花品種的主要呈色色素，其積累量越高花色越偏紅紫 色。花青巧的生物合成起始于苯丙氨酸途徑，由多個酶參與催化，編碼該些酶的基因轉錄水 平受到W化化席日FCW轉錄因子形成的MBW轉錄復合體的協(xié)同調(diào)控。在該S類轉錄因 子中，必陽轉錄因子對花青巧的生物合成調(diào)控具有最高的特異性。W3是高等植物中成員眾多的一類轉錄因子，依據(jù)結構劃分，多數(shù)W巧或員屬于 R2R3類，可參與植物表皮細胞分化、氣孔細胞運動、黃酬類化合物(黃燒酬，花青巧和原花青 巧）生物合成調(diào)控、抵御冷害和干旱、糖響應和抗真菌感染等生命進程。參與植物花青巧生 物合成調(diào)控的W巧或員，已在眾多植物體內(nèi)得到鑒定，然而菊花中參與花青巧生物合成轉 錄調(diào)控的W巧或員至今未見報道，極大地限制了菊花花色品質(zhì)改良育種及其產(chǎn)業(yè)多元化的 發(fā)展。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是提供一個參與菊花花瓣花青巧生物合成轉錄調(diào)控的必陽轉錄因 子恐6,其核巧酸序列如SEQ;N0. 22所示，具體特征如下； 1.序列特征 菊花恐6(SEQ;N0. 22)的編碼序列全長為765個核巧酸，可編碼一個含255氨基 酸的蛋白。CmMYB6蛋白序列中含有保守的R2R3 結構域，在轉錄因子大家族中屬于 R2R3亞組。在CmMYB6的R3 結構域中，存在一個保守的巧/E化x2[R/口x3Lx化x3R基 序，可與bHLH轉錄因子相互作用，共同行使功能。此外，R3 結構域中還含有一個ANDV 基序，該基序存在于許多參與花青巧生物合成調(diào)控的必陽轉錄因子序列中。[000引 2.基因功能 在菊花花瓣的發(fā)育過程中，公6(SEQ;N0. 22)的基因表達呈顯著上升趨勢，與花青 巧的積累呈良好正向相關性。紅例顯著誘導菊花花青巧合成關鍵基因。?化7據(jù)動子活 性，進而增強花青巧的積累，且該一誘導效應受到轉錄因子的加強。 本專利技術的另一個目的是提供必陸轉錄因子紐掀公6 (SEQ;N0. 22序列）在植物顏 色修飾的基因工程中應用，尤其在植物花青巧生物合成的轉錄調(diào)控中的應用。 與化A化W協(xié)同在煙草葉片瞬時表達時，可強烈誘導花青巧的積累，使得 葉片呈現(xiàn)紅色表型。基于此，。《S6(SEQ;N0. 22)可用于植物花青巧生物合成的轉錄調(diào) 控，進而改變植株顏色。 恐6(SEQ;N0. 22)是菊花中首例報道的可調(diào)控花青巧生物合成，進而修飾植 株色澤的必巧成員。 本專利技術W紫色切花菊'阿美地'為試材，應用RACE、實時定量PCR和瞬時表達等生 物學技術，分離鑒定出參與'阿美地'花瓣花青巧生物合成調(diào)控的必恐成員公6 (SEQ; NO. 22)。研究發(fā)現(xiàn)，隨著'阿美地'花瓣中花青巧的積累，公6表達上調(diào)，與其呈良好正 向相關；公例增強菊花花青巧生物合成關鍵基因。巧垢動子活性，且與化A化公計辦 同表達可顯著誘導煙草葉片花青巧的積累。本專利技術利用RACE、實時定量PCR、雙巧光素酶系 統(tǒng)技術和煙草瞬時表達技術，分離并鑒定出菊花。(SEQ;N0. 22)對花青巧生物合成 具有轉錄調(diào)控效應，可應用到植物顏色修飾的基因工程中。【附圖說明】 圖1 ;菊花4個W忍基因在花瓣發(fā)育過程及不同組織中表達模式分析。 圖2 ;菊花4個W忍基因在不同組織中表達模式分析。 圖3 ;菊花4個必巧基因?qū)ㄇ嗲珊铣苫颉Ｇ晒竸幼拥恼{(diào)控效應分析。 圖4 恐6(SEQ;N0. 22)誘導花青巧生物合成功能的鑒定。 具體實施例 下面結合附圖和實施例，W不具有調(diào)控花青巧生物合成功能的基因紐似（SEQ; NO. 19)、6M瓜公沈Q;N0. 20)和 做5(沈Q;N0. 21)，W及C滅做6(沈Q;N0. 22)為 例，對本專利技術做進一步闡述，但實施例不限制本專利技術的保護范圍。 在下述實施例中常規(guī)的基因操作方法參照《分子克隆實驗指南》（第=版)。 實施例1;菊花。《^基因克隆 依據(jù)菊花RNA-Seq數(shù)據(jù)庫信息，篩選出四個可能參與菊花花青巧生物合成調(diào)控的必恐 轉錄因子CffifeT公義CffifeT公朵。巧日CffifeT公6,其中CffifeT公6已含有部分開放型閱讀框（0RF) 序列及3'非編碼區(qū)（3'UTR)序列（SEQ;N0. 1)，C滅T公沈Q;N0. 2)和做5(沈Q;N0. 3)已含有部分0RF序列及5'UTR序列。應用基因特異引物2 (GSP2)SEQ;N0. 4、SEQ;N0. 5 和SEQ;N0. 6，W及巢式基因特異引物 2(NGSP2)SEQ;N0. 7、SEQ;N0. 8 和SEQ;N0. 9,利 用3'cDNA末端快速擴增（3'RACE)技術分別獲得瓜似（SEQ;N0. 10)、恐4(SEQ; NO. 11)和做5"(569;祖12)的（3'UTR)序列。進而應用基因特異引物1(GSP1)SEQ; NO. 13 和SEQ;N0. 14，W及巢式基因特異引物 1(NGSP1)SEQ;N0. 15 和SEQ;N0. 16,利 用5'cDNA末端快速擴增（5'RACE)技術分別獲得瓜似（SEQ;N0. 17)和恐6(SEQ; NO. 18)的5'非編碼區(qū)（5'UTR)序列。[001引 RACE程序中第一輪PCR程序為94°C，5min，5個循環(huán)的94°C10S和72°C2min30 s，5 個循環(huán)的 94°C10s，70°C30s和 72°C2min30s，30 個循環(huán)的 94°C10s，67°C30s和 72°C2min30s，72°C10min，4°Chold。第二輪PCR程序為 94°C，5min，30 個循環(huán)的 94°C 10s，65°C30s和 72°C2min30s，72°C10min，4°Chold。 RACE第一輪PCR體系為10 X Ex-Buffer 2 uL，2.5 mmol/L dNTPs1.6uL，10 ymol/L GSPl或GSP2 0. 5 uL，下游引物UPM 2 uL，Ex-hq 0. 1 uL，cDNA 0. 5 uL，加 滅菌雙蒸水至20 uL。第二輪PCR體系為lOXEx-Buffer 2 uL，2.5 mmol/L dNTPs1.6 UL，10 ymol/LNGSPl或NGSP2 0.5 uL，下游引物NUP2 yL，Ex-Taq0.1 uL，稀釋10 倍的第一輪PCR產(chǎn)物1uL加滅菌的雙蒸水至20 uL。 根據(jù)3'和5'UTR拼接得到自起始密碼子（ATG)至終止密碼子的恐J(SEQ; NO. 19)、C滅T公4 (沈Q;N0. 20)、做5(沈Q;N0. 21)和C滅T公6 (沈Q;N0. 22)的全長 序列。 實施例2;菊花做基因表達模式分析 (一）實驗方法 利用Prime本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一個參與花青苷生物合成調(diào)控的MYB轉錄因子，其特征在于，是參與菊花花瓣花青苷生物合成轉錄調(diào)控的MYB轉錄因子CmMYB6，其核苷酸序列如SEQ：NO.?22所示。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：李方，劉曉芬，向理理，殷學仁，陳昆松，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33