一種豬源產腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種豬源產腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白及其應用，本發明專利技術提供了一種豬源ETEC3個拷貝基因fliC的重組質粒pRSET-3FliCon。將該重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，誘導重組表達菌BL21(DE3)/pRSET-3FliCon表達融合蛋白3FliCon。利用表達的重組蛋白主動免疫新西蘭雄兔，制備了針對這種蛋白的血清抗體，驗證了重組蛋白具有良好的抗原性，培養腸上皮細胞系IPEC-J2，利用抑制粘附試驗，證明了豬源ETEC鞭毛在參與粘附小腸上皮細胞過程中起重要作用。利用該融合蛋白制備的雞卵黃抗體能抑制ETEC在體外對上皮細胞的粘附，且抑制不同血清型的ETEC菌株。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子生物學
，具體涉及一種豬源產腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白 3FliCon融合蛋白及其應用，通過構建豬源腸毒素大腸桿菌的3個拷貝的鞭毛基因fliC重 組質粒pRSET-3FliCon，將其轉入大腸桿菌表達融合蛋白。利用該融合蛋白制備的雞卵黃抗 體能抑制ETEC在體外對上皮細胞的粘附，且抑制不同血清型的ETEC菌株。
技術介紹
ETEC是引起新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的最主要病原菌之一（Nagy et al.，1990;Harel et al.，1991)。其引起的腹瀉死亡率上升，使得生產效率降低和治療成 本增高，給畜牧業造成了巨大的經濟損失（Gaastra and Svennerholm, 1996)。ETEC引起腹 瀉的毒力因子主要包括：粘附素和腸毒素（Turner et al.，2006)，其能夠形成多種毒力因 子以適應宿主（Smith and Halls，1967)。ETEC通過粘附素介導粘附腸粘膜上皮細胞，以便 細菌定殖并大量繁殖，隨后分泌大量的腸毒素，造成腸粘膜上皮細胞的病理變化，引起腹瀉 (Qadri et al. , 2005)〇 在世界養豬業中ETEC是引起仔豬腹瀉的主要的病原菌之一（Broes et al.，1988)。由于腸道大腸桿菌引起的一些疾病對養豬業造成了很大影響，引起人們對仔豬 管理方面的重視。現在仔豬腹瀉較明顯的主要導致出生1-7天新生仔豬腹瀉和斷奶后一周 的斷奶仔豬腹瀉（Amezcue et al.，2002;Verdonck et al.，2002)。ETEC引起的新生仔豬 和斷奶仔豬腹瀉對養豬業造成了巨大損失，主要體現為仔豬腹瀉，導致生長停滯，提高死亡 率等（Verdonck et al.，2002)。據Gyles報道，在養豬業中，ETEC引起的腹瀉是最普遍的 腸道疾病，全球每年100, 〇〇〇頭腹瀉仔豬中死亡率高達50% (Gyles，1994)。 鞭毛主要是螺旋菌、弧菌及多數桿菌和少數球菌的細胞膜表面一種絲狀結構蛋 白，不僅是細菌的運動器官，而且鞭毛與細菌毒力有關，它在細菌的趨化作用和運動性中起 重要作用（Bardy et al.，2003)。現有研究發現細菌的鞭毛能參與粘附粘膜和上皮細胞， 如：綠膿桿菌（Arora et al.，1996)、霍亂弧菌（Richardson et al.，1991)、幽門螺桿菌 (Eaton et al.，1996)、類鼻疽伯克霍爾德菌（Brett et al.，1994)。Chua等采用同源重 組技術對假單胞桿菌強毒株KHW的fliC基因缺失突變，研究發現該突變菌株無鞭毛，并且 在半固體瓊脂培養基上無運動性。實驗證明，與野生型假單胞桿菌相比，其繁殖能力并沒 降低，但喪失了毒力功能。在感染老鼠后，從小鼠肺和脾中幾乎分離不到該細菌。Jorge等 (2002)用腸致病性大腸桿菌（EPEC)感染3h的HeLa細胞，通過利用免疫熒光標記對鞭毛進 行標記，發現EPEC的鞭毛能夠直接參與該細菌粘附宿主細胞，但發現其運動功能對其粘 附宿主細胞作用不大。 Koushik Roy等（2009a)發現人源的產腸毒素大腸桿菌（H10407)分泌的雙伴侶 分泌蛋白EtpA (雙伴侶胞外分泌蛋白）能夠介導鞭毛與腸上皮細胞（HCT-8和Caco-2細胞 系）粘附過程。通過試驗作者發現抗EtpA抗體和抗鞭毛蛋白抗體能夠抑制多種H血清型 的ETEC粘附宿主細胞。為預防ETEC性腹瀉提供兩種具有一定廣譜性的免疫抗原。在參與 粘附過程中，Koushik Roy等通過構建完整（l_498aa)和不完整的FliC蛋白（l_173aa和 174-498aa區域)進行免疫共沉淀捕獲EtpA蛋白，發現完整的FIiC蛋白和不完整的FliC蛋 白（l-173aa區域）都能與EtpA蛋白作用，而不完整的FliC蛋白（174-498aa區域）不能與 EtpA蛋白作用，同時以完整的FliC蛋白和不完整的FliC蛋白（l-173aa區域）兩個蛋白作 為免疫原都能起到抑制細菌粘附宿主細胞的效果，也進一步確定了參與粘附作用的主要是 鞭毛蛋白FliC的保守區域（l-173aa區域)。現有研究報道，豬源ETEC (F18ab)鞭毛蛋白 作為一種重要的毒力因子參與感染豬源細胞系IPEC-J2(Duan et al.，2012)。從而推測豬 源ETEC鞭毛蛋白可以作為一種候選蛋白作為預防仔豬腹瀉的疫苗研制。 大量研究結果表明，通過給幼齡動物提供外源抗體(包括血清抗體和卵黃抗體）能 夠有效的提高被動免疫水平，對于預防和治療細菌和病毒感染(特別是腸道腹瀉）是一種較 為有效的途徑（Hatta et al.，1993;王劼，2007)。 基于以上研究背景，本研究以鞭毛蛋白FliC保守區域作為候選抗原，利用基因工 程方法克隆表達含3個拷貝的FliC保守區域的融合蛋白，獲得大量目的蛋白。通過免疫新 西蘭雄兔來生產針對FliC抗原的特異性多克隆血清抗體，旨在制備一種成本低廉的具有 預防仔豬腹瀉的疫苗。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供了一種豬源ETEC3個拷貝基因fliC的重組質粒 pRSET-3FliCon，其序列為 SEQ ID NO. 1 所示。 本專利技術的另一個目的在于提供了一種含有重組質粒pRSET-3FliCon的基因工程 菌。將重組質粒pRSET-3FliCon轉化入大腸桿菌（Escherichia coli)BL21 (DE3)，該基因 工程菌能夠表達鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白。 本專利技術還有一個目的在于提供了一種豬源產腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白3FliCon 融合蛋白，其序列為SEQ ID NO. 2所示。該融合蛋白免疫原性好，生產成本低。利用該融合 蛋白制備的兔血清抗體，可在體外有效抑制大腸桿菌粘附。將該蛋白免疫蛋雞后，可獲得具 有抗ETEC的雞蛋。 本專利技術還有一個目的在于提供了一種人源產腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白2FliC融 合蛋白的復性方法，方法簡單，易行，采用SKL，氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽對表達的 目的蛋白進行復性。在后期免疫過程中獲得了較高效價的卵黃抗體。 本專利技術還有一個目的在于提供了一種利用3FliCon融合蛋白制備的卵黃抗體，該 卵黃抗體具有廣譜性抑制ETEC粘附的作用。 本專利技術最后一個目的在于提供了一種卵黃抗體在制備抗豬源產腸毒素大腸桿菌 免疫疫苗中的應用。 本專利技術是通過以下技術方案實現的： 一種重組質粒pRSET-3FliCon的制備方法（圖1)，其具體步驟如下： 在NCBI中查找序列號AY906918全長1464bp，保守區是5 z端的519bp。以豬源 產腸毒素大腸桿菌標準菌株K88ac為試驗材料，設計引物。本專利技術克隆的重組質粒，是利用 多串聯體構建技術等基因工程技術和利用BamHI和BglII-對同尾酶的原理，將3個編碼 鞭毛5z端保守區的核苷酸序列插入原核表達載體pRSET-B中構建而成。將構建好的重組 質粒命名為pRSET-3FliCon，其序列為SEQ ID NO. 1所示。 重組蛋白3FliCon誘導表達及提取純化 -種豬源鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白，其制備方法如下： 將重組質粒pRSET-3FliCon轉化大腸桿菌B本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種豬源ETEC3個拷貝基因fliC的重組質粒pRSET?3FliCon，其序列為SEQ?ID?NO.1所示。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：彭健，潘中勉，蔣思文，王榮，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：湖北;42