本發明專利技術涉及一種基于適配體靶向遞送microRNA的納米載體及其制備方法與應用。其中靶向分子為巰基修飾的MUC-1分子，可與抑癌性microRNA-34a結合，使MicroRNA-納米金剛石-魚精蛋白復合體(MNPs)成為具有主動靶向功能的AMNPs。通過靜電相互作用，將帶負電荷的aptamer-microRNA(Apt-miR)嵌合體吸附于陽離子性魚精蛋白-納米金剛石基載體，構成三元復合載體。進行納米轉運體系對非小細胞肺癌的治療效果的研究。Apt-miR嵌合體免疫原性小，經修飾的MUC-1核酸適配體在生物體內化學穩定性好，并且易于化學合成。為提高其轉染效率，使用魚精蛋白修飾的納米金剛石材料(NPs)幫助miRNA通過滲透和滯留增強效應增加其在腫瘤部位的積累。
【技術實現步驟摘要】
： 本專利技術屬于納米材料生物學領域。本專利技術涉及一種具革El向性的負載microRNA的 納米載體及其制備方法，具體涉及一種MUC-I革El向性魚精蛋白修飾的納米金剛石載體的制 備方法及其在肺癌治療中的應用。
技術介紹
： MicroRNA (miRNA)是一類內源性非編碼RNA，長度為20-25個堿基之間。MicroRNA 通過與mRNA的3'-非編碼區（3'-UTR)結合，形成局部堿基配對以抑制mRNA的翻譯或使其 降解。一種microRNA可以與mRNA的多個位點結合，一種基因的表達結果也可能被不同的 microRNA所調節。許多microRNA在不同癌癥中表達異常，提示microRNA與癌癥的發生發 展密切相關。不同的MicroRNA在癌癥中扮演著不同的角色，有一些microRNA具有類似癌 基因的作用，在一些癌癥細胞中表達較高，能夠通過負向調控腫瘤抑制基因或通過調控細 胞周期、分化、凋亡過程，刺激細胞增殖，促進腫瘤內部血管生成，這些致癌性microRNA被 稱為oncomirs ;而另一類microRNA則扮演著強有力的抑癌基因的角色，被稱作抑癌miRNA。 越來越多的miRNA被應用到癌癥治療中，但是仍然存在重要的問題，就是如何保 證這些無基因特異性的miRNA進入腫瘤細胞發揮治療效果的效率。因此，為miRNA尋找優 秀的具有靶向效應的穩定載體是更好地發揮miRNA療效的捷徑。目前治療癌癥最常用且有 效的方法仍是聯合化療放療法，但這種方法不可避免地會對人體造成傷害。因此，能夠遞送 特定抗腫瘤藥物的新型載體越來越受到青睞。這些藥物載體可以彌補藥物的局限性，控制 藥物在體內的釋放速率，并且可降低藥物對非腫瘤細胞的作用以避免細胞毒性的產生。納 米金剛石是一種碳納米材料，使用納米金剛石作為microRNA載體治療癌癥，具有毒性低， 生物相容性高，能夠延長被載藥物在腫瘤部位的停滯時長等。 核酸適配體（Aptamer)是一類具有特異性結合祀標分子、核酸或蛋白質的單鏈 DNA或RNA。納米材料載體經化學修飾后可以進一步與核酸適配體結合，將靶向治療效率大 大地提高。經納米載體負載的核酸適配體極大地降低其免疫原性，不易被生物體降解，提高 自身負載治療藥物或分子的富集性，增強治療效果。
技術實現思路
： 本專利技術為一種適配體革El向遞送microRNA的納米載體制備方法及應用。具體地說， 本專利技術以魚精蛋白修飾的納米金剛石載體，以核酸適配體-microRNA嵌合體（Apt-miR)作 為功能性負載物祀向治療肺癌，該復合載體（核酸適配體-microRNA-納米金剛石）制備快 捷方便，細胞毒性低，靶向治療效果良好。 -種具祀向性的負載microRNA的納米載體，其特征在于，所述載體為經過魚精蛋 白硫酸鹽修飾的納米金剛石，該載體為陽離子性。 進一步，其中納米金剛石是通過爆炸法產生。 進一步，魚精蛋白硫酸鹽來源于鮭魚。 進一步，其中單個納米金剛石粒徑為4-6nm，平均動力學尺寸為40-60nm，表面 zeta 電位為 13_18mV。 進一步，其中所述的 microRNA 為 Hsa_miR-34a。 進一步，靶向性分子為巰基修飾的MUC-I分子。 制備納米金剛石-MUC-1-miR-34a嵌合體復合納米載體AMNPs的方法，其特征在于 包括以下步驟： (1)將150mg/mL的納米金剛石凝膠溶液溶于去離子水中，稀釋為終濃度lmg/mL ; 在100W功率下過夜超聲反應稀釋后的ND溶液； (2)將50mg魚精蛋白硫酸鹽溶于5mL去離子水中，使魚精蛋白硫酸鹽溶液終濃度 為 10mg/mL ; (3)將納米金剛石凝膠溶液與魚精蛋白硫酸鹽溶液按質量比1:15混合成為NPs溶 液，37 °C孵育48小時進行自組裝反應； (4) 48小時后，將NPs混合液12000rpm離心15分鐘；棄上清液，得到的NPs小球 使用去離子水重新分散，再次離心沉淀洗滌，重復這一步驟三次；最后將沉淀凍干并溶于去 離子水，調整濃度為〇. 6mg/mL ; (5)將SPDP修飾的miR-34a mimics溶解于ImL無 RNA酶水中，得到濃度為80 μ g/ mL RNA的溶液，按照質量比1: 4RNA的溶液與NPs溶液混合，室溫孵育30分鐘使其進行組裝 反應得到MNPs ; (6)按MUC-I :miR-34a摩爾比為1:2的比例將巰基修飾的MUC-I分子與MNPs過夜 孵育，組裝成AMNPs。 進一步，其中步驟（5)將SPDP修飾的miR-34a mimics具體為：將I. 25nmol5'端帶 有氨基的miR-34a mimics溶于200 μ L PBS中得到miR-34a稀釋液，同時按SPDP:miR-34a 摩爾比為1:20將0. 0625nmol SPDP交聯劑溶于20 μ L DMSO得到SPDP工作液，將miR-34a 稀釋液與SPDP工作液混合，孵育2小時。反應后，過量的SPDP通過超濾離心管多次離心分 離出去。 上述方法制備的AMNPs。 上述方法制備的AMNPs作為肺癌治療藥物中的應用。 首先，本專利技術使用經過魚精蛋白硫酸鹽（Protamine sulfate，PS)修飾的納米金剛 石碳納米材料（Nanodiamond，ND)作為microRNA的輸送載體（NPs)，其優點是細胞轉染效 率高，可以快速高效地被細胞吸收。其次，利用Mucin-1 (MUC-I)核酸適配體作為目標配體， 設計合成一段長約25base的脫氧核苷酸單鏈結構，與microRNA-34a(miR-34a)形成嵌合體 結構，負載于NPs之上，以增加其遞送至肺癌的革El向性，從而增強microRNA的治療效率。 魚精蛋白是一種主要來源于魚類的堿性蛋白質，具有較高的熱穩定性，同時表現 出抑菌特性和生物活性。水溶性的魚精蛋白硫酸鹽通過氫鍵、表面電荷作用，能夠吸附于納 米金剛石表面；納米金剛石是一種碳納米材料，與其它納米材料相比具有毒性小，生物相容 性較好等特點，其表面富集大量的羥基、羧基、羰基易與魚精蛋白中的氨基結合，形成魚精 蛋白包裹納米金剛石的納米顆粒，經此修飾后，NPs表面帶有正電荷，能夠吸附帶有負電的 microRNA〇 Mucinl粘蛋白（MUC-I)是一種細胞表面糖蛋白，屬I型跨膜蛋白，在正常情況下 多表達于各器官組織的上皮細胞中。這種糖蛋白在許多種類的腫瘤包括非小細胞肺癌細胞 表面都是表達高于正常水平的。由于MUC-I核酸適配體和miR-34a都是核苷酸，因此可以 經SPDP交聯劑修飾后形成嵌合體；STOP (3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯） 能夠與化合物上的氨基反應生成穩定的酰胺鍵，同時分子中的α -吡啶基對巰基敏感，發 生巰基-二硫基交換反應生成新的二硫鍵。在適當的條件下這兩種反應同時進行而互不干 擾。這種交聯方法副反應少，結合物產率高。 由于納米金剛石微粒在水溶液中成簇存在，所以使用前需要被超聲振動分散。但 是這種分散仍不能夠將納米金剛石微粒分為單獨個體，仍是以小簇型式存在，經過ZETA電 位表征可知其表面zeta電位為15mV左右，穩定狀態下直徑約為52nm左右，而單一納米顆 粒理論直徑為4nm左右。成團存在的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種具靶向性的負載microRNA的納米載體，其特征在于，所述載體為經過魚精蛋白硫酸鹽修飾的納米金剛石，該載體為陽離子性。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張芳，辛婧，王怡慧，鄧雄威，盛望，
申請(專利權)人：北京工業大學，
類型：發明
國別省市：北京;11
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