用于檢測單核苷酸多態性的引物、試劑盒及其檢測方法技術

本發明專利技術屬于生物技術領域，公開了一種用于檢測單核苷酸多態性的引物和試劑盒，及單核苷酸多態性的檢測方法，該檢測方法包括以下步驟：1）直接將樣品分別裝入A管和B管，并與上述試劑盒所述試劑充分混合，所述A管裝有野生型正向引物或反向引物，B管裝有突變型正向引物或反向引物，所述A、B兩管內的其余成分相同；2）將步驟1）的混合液瞬時離心后進行熒光定量PCR擴增；3）根據A管擴增曲線CtA值與B管擴增曲線CtB值的差值△Ct判斷目標位點的基因類型。本發明專利技術所用樣品無須進行DNA提取，只需微量即可檢測的一管式反應，通過優化了引物設計，提高了檢測準確性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，特別涉及一種。
技術介紹
Real-time PCR是一項目前廣泛應用于科研、臨檢的DNA擴增技術，它將微量的DNA或RNA模板數量放大百萬倍以上，以形象的邏輯斯蒂曲線將產物的變化過程描繪出來，以便人們觀測基因的有或無，多與少，正常或者發生變異(突變、重復、缺失、易位等)。在Real-time PCR中，最為可靠也是最常用的是Taqman探針技術。它和普通PCR技術相比，Real-time PCR具有以下優勢特征:(I)熒光探針和模板的雜交過程在密閉反應管中進行，不會造成普通PCR的氣溶膠污染；(2)實時監控反應的整個過程，對異常情況(如信號突增)有更好的判斷；(3)采用熒光探針技術，不僅量化準確，而且保證了整個反應的敏感和特異性。然而，對于僅發生一個堿基突變的靶序列，檢測十分困難。目前運用的方法主要有限制性內切酶片段切割法，ARMS法，MGB探針法、芯片雜交法等。這些方法主要應用于科研，操作較為繁雜冗長，結果穩定性差，不易判讀，在臨床應用上受到諸多限制。后來，研究人員在ARMS法的基礎上,結合突光定量PCR技術,發展出TaqMAMA方法(Taqman mismatchamplificat1n mutat1n assay),該技術對模板和弓I物的匹配度做了改進，使得擴增特異性大幅增加，有效獲得單堿基突變的識別效果。近年來發展起來的一些類似技術較好解決了之前操作復雜，穩定性差的問題，但依然存在以下缺陷:(1)不能直接用于全血、尿液、組織液、植物粗提液等樣本類型的擴增；(2)對野生型、突變型及雜合型的區分度不夠高；(3)對樣本的新鮮程度、樣本量有較為苛刻的要求。
技術實現思路
專業術語:“Ct值”是指使用熒光定量PCR方法檢測DNA時，擴增產物的熒光信號達到閾值時所需要的循環數。由于是兩管反應同時進行，所以Ct值分別以CtA和CtB表示。本專利技術的目的在于提供一種用于檢測單核苷酸多態性的引物。為實現上述目的，本專利技術提供一種用于檢測單核苷酸多態性的引物，針對基因突變位點，設計野生型正向引物和突變型正向引物，或者設計野生型反向引物和突變型反向引物，在每組所述野生型和突變型正向引物的3’端倒數第三個堿基引入一個突變點，或者在每組所述野生型和突變型反向引物的3’端倒數第三個堿基引入一個突變點，增加引物和模板的不匹配度；每組所述野生型和突變型正向引物的3’端最后一個堿基不同，或者每組所述野生型和突變型反向引物的3’端最后一個堿基不同。優選的，所述每組所述野生型和突變型正向引物的3’端倒數第三個堿基相同，或者每組所述野生型和突變型反向引物的3’端倒數第三個堿基相同。本專利技術的另一目的在于提供一種試劑盒，該試劑盒含有上述引物。優選的，該試劑盒還包括PCR反應緩沖液、dNTP、DNA聚合酶、正向弓丨物或反向引物和Taqman探針。優選的，根據野生型正向引物和突變型正向引物設計反向引物，或者根據野生型反向引物和突變型反向引物設計正向引物。優選的，所述DNA聚合酶為耐高溫及熱啟動的酶，可常溫儲存。本專利技術的另一目的在于提供一種用于檢測單核苷酸多態性的試劑盒的檢測方法，該檢測方法包括以下步驟，I)直接將樣品分別裝入A管和B管，并與上述試劑盒所述試劑充分混合，所述A管裝有野生型正向引物或反向引物，B管裝有突變型正向引物或反向引物，所述A、B兩管內的其余成分相同；2)將步驟I)的混合液瞬時離心后進行熒光定量PCR擴增，所述離心時間3s為最佳；3)根據A管擴增曲線CtA值與B管擴增曲線CtB值的差值Λ Ct判斷目標位點的基因類型，優選的，所述判斷標準為CtA-CtB〈-5，則該基因為野生型；CtA-CtB>5，則該基因為突變型；|CtA-CtB|〈3，則該基因為雜合型。優選的，所述步驟I)中樣品為抗凝全血、尿液、精液、淋巴液、組織液或植物粗提液坐寸ο優選的，所述樣品的用量不大于I μ I。優選的，所述步驟2)的擴增過程分為預變性和循環兩個階段進行，循環階段為兩溫循環或三溫循環，循環次數為40個或以上。本專利技術的有益效果為:1、樣品無須進行DNA提取，只需微量即可檢測；2、一管式反應，可立即進行擴增反應；3、DNA聚合酶的選擇上，采用更耐高溫及熱啟動的酶，常溫運輸儲存即可，無需冷鏈運輸，大大降低了使用成本；4、優化了引物設計，提高了檢測準確性。【附圖說明】圖1CYP2C19基因681位點的熒光擴增曲線圖(a)；圖2CYP2C19基因681位點的熒光擴增曲線圖(b)；圖3CYP2C19基因681位點的熒光擴增曲線圖(C)；圖4ALDH2基因1510位點的熒光擴增曲線圖(a)；圖5ALDH2基因1510位點的熒光擴增曲線圖(b)；圖6ALDH2基因1510位點的熒光擴增曲線圖(C)；圖7經堿基錯配位置優化后的熒光擴增曲線圖；圖8專利CN101235415B中實施例1方法的熒光擴增曲線圖。【具體實施方式】以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實施例1CYP2C19*1、*2 分型CYP2C19*2是指681位點由G (鳥嘌呤)突變為A (腺嘌呤)。此突變會導致細胞色素酶CYP2C19活性喪失，氯吡格雷藥效明顯減弱。為檢測此突變，引物探針序列設計如下，正向引物:5’-CCAGAGCTTGGCATATTGTATC-3’ ；野生型反向引物:5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTGCC-3’ ；突變型反向引物:5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTGCT-3’ ；反向探針:5，-GAAAATTATTGCATATCTAAGAGAA-3，；將Iul EDTA抗凝全血與DNA聚合酶，PCR反應緩沖液，dNTP，引物探針在兩個反應管內充分混合。A管裝有正向引物，野生型反向引物和反向探針出管裝有正向引物，突變型反向引物和反向探針。兩個管內除了反向引物不同外，其余組分完全相同。每人份反應液(25 μ I)包含 5ymol/L 正、反向引物各 I μ l,5ymol/L 探針 0.5 μ 1，lOmmol/LdNTP0.4 μ 1，DNA聚合酶0.1μ 1，2XPCR反應緩沖液12.0 μ 1，超純水9 μ I以及1μ I全血。檢測采用Agilent ΜΧ3000Ρ熒光定量PCR儀。PCR擴增檢測條件設為95°C 5分鐘，45個循環(98°C 10秒，60°C熒光檢測40秒)。反應結束后，打開熒光擴增曲線界面，把基線范圍設定為10至22，將閾值線拉至曲線熒光最大值的1/10處，即可得到兩個反應的Ct值CtA和CtB。此處CtA為裝有野生型引物的反應得到的Ct值，CtB為裝有突變型引物的反應得到的Ct值。結果判斷:如圖1所示，CtA-CtB〈_5，則CYP2C19基因681位點為突變型GG，可標記為*1/*1 ;如圖2所示，CtA-CtB>5，則CYP2C19基因681位點為突變型AA，可標記為*2/*2 ；如圖3所示，CtA-CtB|〈3，則CYP2C19基因681位點為雜合型GA，可標記為*1/*2。實施例2ALDH21510位點G — A突變檢測ALDH2編碼乙醛脫氫酶，1510位點發生突變(G變為A)將導致乙醛脫氫酶失活，此基因突變的患者無法代謝酒精以及硝酸甘油等藥物。為檢測本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測單核苷酸多態性的引物，其特征在于，針對基因突變位點，設計野生型正向引物和突變型正向引物，或者設計野生型反向引物和突變型反向引物，在每組所述野生型和突變型正向引物的3’端倒數第三個堿基引入一個突變點，或者在每組所述野生型和突變型反向引物的3’端倒數第三個堿基引入一個突變點，以增加引物和模板的不匹配度；每組所述野生型和突變型正向引物的3’端最后一個堿基不同，或者每組所述野生型和突變型反向引物的3’端最后一個堿基不同。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：周高英，余占江，
申請(專利權)人：北京樂普醫療科技有限責任公司，
類型：發明
國別省市：北京;11