一種利用蜈蚣草莖葉勻漿快速獲得其組培苗的方法技術

本發明專利技術涉及一種利用蜈蚣草莖葉勻漿快速獲得其組培苗的方法，屬植物組織培養技術領域。本發明專利技術方法是指將蜈蚣草的不同外植體，經過無菌處理，預培養之后，將外植體進行愈傷組織誘導培養，愈傷組織轉入增殖培養基，形成綠色球狀體(GGB)，GGB經過兩次分化培養后，獲得小苗和新的愈傷組織，將小苗進行生根培養，新的愈傷組織進行增殖培養形成GGB，周而復始，從而獲得大量組培苗。本發明專利技術的有益效果是：外植體污染率低；外植體無褐化現象，形成了蜈蚣草快繁的技術效果；能夠直接分化成新的組培苗，大大縮短了蜈蚣草的繁殖周期，有利用于工廠化大批量生產，形成繁殖系數高的技術效果；采用不同的光照強度避免了愈傷和分化苗的玻璃化，形成了良好的培養效果。

【技術實現步驟摘要】
一種利用蜈蚣草莖葉勻漿快速獲得其組培苗的方法
：本專利技術涉及一種利用蜈蚣草莖葉勻漿快速獲得其組培苗的方法，屬植物組織培養

技術介紹
：蜈蚣草(PterisvittataLinn.)屬于鳳尾蕨科Pteridaceae、鳳尾蕨屬Pteris，多年生草本植物，可作為鈣質土和石灰巖的指示植物，具有較高的觀賞、藥用和環保價值。在觀賞價值方面，由于其羽葉優美，栽培較為廣泛，并且常用于配置山石盆景；在藥用價值方面，據植物志記載，蜈蚣草亦可全草入藥，有解毒、祛風除濕、殺蟲、治疳瘡、止血、止瀉等功效；在環保價值方面，蜈蚣草對砷等重金屬的耐性和富集能力極強，在重金屬污染的土壤和水源的修復中具有重要價值。蜈蚣草的繁殖一般有成熟孢子繁殖、分株法繁殖和組織培養繁殖等3種方法。成熟孢子繁殖和分株法繁殖效率不高，耗時長，目前蜈蚣草的繁殖多集中在利用組織培養方法上。現有的蜈蚣草組織培養技術，多采用蜈蚣草的孢子萌發成配子體，再用配子體誘導愈傷組織，最終獲得組培苗，但蜈蚣草野外收集孢子和室內孢子無菌處理較艱難，孢子輕，易漂浮，處理過程繁瑣，不易操作。羅利瓊等，2011年在安微農業科學發表的《鳳尾蕨科植物蜈蚣草的組織培養》中，為克服傳統的孢子繁殖帶來的一系列問題，以野生蜈蚣草幼嫩葉芽為外植體，通過激素配比試驗，成功地篩選出蜈蚣草愈傷組織誘導和繼代培養的培養基配方，簡化了組織培養的步驟，能夠在2個月內培育出蜈蚣草幼苗，但未介紹蜈蚣草的成苗率。就以上介紹蜈蚣草組織培養的方法共性還在于，相關培養基的配置只是調整植物激素和大量元素，微量元素，有機碳源的比例來完成。我們通過相關文獻介紹的培養基組合，經過多次試驗，成苗率很低甚至無法成苗。早在20世紀就有人針對難培養的材料，在其培養基中附加天然提取物(如椰乳、玉米胚乳、香蕉汁等)，從而得到了很好的培養效果，尤其在提高分化率和防止褐化效果方面較為顯著。而蜈蚣草在培養過程中，褐化較為嚴重，現有的培養方法是添加防止褐化的氧化劑，如活性炭和PVP，但在整個培養過程中，都需要加入這些氧化劑，增加了過程的繁瑣，也造成相關試劑的浪費。到目前為止，應用天然提取物進行蜈蚣草快繁的方法還未見報道。
技術實現思路
：鑒于上述技術的現狀，本專利技術提供了一種利用蜈蚣草莖葉勻漿快速獲得其組培苗的方法，旨在提供一種適用于蜈蚣草不同外植體通用的培養基，為蜈蚣草的培育提供一種新的技術平臺。本專利技術提供一種利用蜈蚣草的莖葉勻漿快速獲得其組培苗的方法，是指將蜈蚣草的不同外植體，經過無菌處理，預培養之后，將外植體進行愈傷組織誘導培養，愈傷組織轉入增殖培養基，形成綠色球狀體(GGB)，GGB經過兩次分化培養后，獲得小苗和新的愈傷組織，將小苗進行生根培養，新的愈傷組織進行增殖培養形成GGB，周而復始，從而獲得大量組培苗。本專利技術中，所述的蜈蚣草不同外植體，是選用蜈蚣草幼嫩葉片和剛從地下冒出4-6厘米的幼芽。本專利技術中，所述的無菌處理，是將蜈蚣草葉片和幼芽用自來水沖洗10分鐘，用3％的質量體積比洗衣粉充分溶解，浸泡幼芽，并不斷攪動，10分鐘后，再用流動的自來水沖洗30分鐘，用吸水紙吸干多余水份置超凈臺上備用。將備用的蜈蚣草葉片用70％或75％體積比的酒精表面滅活30秒，再用0.1％質量體積比的氯化汞消毒6分鐘或8分鐘，無菌水沖洗5遍或6遍，用無菌濾紙吸干多余水份，待用。本專利技術中，所述的預培養，是將幼芽接種到預培養基(1/2MS+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖10g/L，PH5.8-6.0)上，形成幼孢子體。本專利技術中，所述的愈傷組織誘導培養，是將幼孢子體和無菌處理好的幼嫩葉片，切成小段，接入誘導培養基(1/2MS+2,4-D2mg/L+(蜈蚣草莖干和葉勻漿)80g/L+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0或1/2MS+2,4-D2mg/L+(蜈蚣草莖干和葉勻漿)60g/L+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L,PH5.8-6.0)上，每皿接種20-25個，置于溫度25.8-26℃，濕度60％-70％的培養箱中暗培養，一周后轉到溫度和濕度與暗培養相同，光照2000Lux，光照時間12小時的培養箱中繼續培養。本專利技術中，所述的增殖培養，是將愈傷組織轉入增殖培養基(1/2MS+2,4-D0.5mg/L+(蜈蚣草莖干和葉勻漿)100g/L+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0)上，每皿轉接10-15個愈傷組織，此時溫度、濕度、光照條件與愈傷組織誘導培養一致，12天后，愈傷組織長到1-1.5厘米的綠色球狀體(GGB)。本專利技術中，所述的兩次分化培養，是將增殖后的愈傷組織切成0.3-0.5厘米，接入分化培養基[1/2MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+(蜈蚣草莖干和葉勻漿)120g/L+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0]中進行分化培養，溫度25.8-26℃，濕度50％-60％，光照強度3000Lux，光照時間12小時，一周后將光照調至4000Lux，出現黃綠色小顆粒，繼續分化培養7天后，綠色顆粒隨著長大，并長出芽點和纖細小苗，為第一次分化。接著又將光照調回3000Lux，將長出的芽點和纖細小苗，重新接入新的分化培養基[1/2MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L+(蜈蚣草莖干和葉勻漿)200g/L+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0]中，繼續進行分化培養，7天后，分化的芽點已經長成獨立小苗同時又長出新的叢生芽點和新的愈傷，這個周期為第二次分化培養。本專利技術中，所述的生根培養，是指將綠而壯的小苗接入生根培養基(1/4MS+NAA0.2mg/L+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖15g/L，PH5.8-6.0。)中生根培養。將3-4厘米綠而壯的小苗接入裝有30毫升培養基的玻璃試管中，溫度25.8-26℃，濕度50％-60％，光照強度3000Lux，光照時間12小時，進行生根培養，15-20天后，根芽長出，27天后，主根長2厘米，此時的生根苗即能假植。與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：1、預培養時不添加任何激素，讓外植體在野外環境過度到室內環境。有利于胚性愈傷形成，并且達到了外植體較低污染率的技術效果。2、在誘導愈傷和分化時添加不同濃度的蜈蚣草莖干和葉勻漿，不僅能同時培養蜈蚣草的不同外植體，而且有利于提高愈傷誘導率和分化率，在不添加任何氧化劑的前提下，外植體無褐化現象，形成了蜈蚣草快繁的技術效果。3、利用本專利技術中優化方案再次得到的愈傷組織，能夠直接分化成新的組培苗，28天內就能獲得新的組培苗，大大縮短了蜈蚣草的繁殖周期，有利用于工廠化大批量生產，形成繁殖系數高的技術效果。4、本專利技術在愈傷誘導和分化培養過程中，采用不同的光照強度避免了愈傷和分化苗的玻璃化，形成了良好的培養效果。具體實施方式：實施例一：利用蜈蚣草幼芽誘導愈傷獲得組培苗1、外植體選擇采集每年3月份剛從地下冒出4厘米或6厘米的幼芽蜈蚣草，用浸濕的吸水紙包好，放入自封袋中，置4度冰箱冷藏保鮮、保濕。2、外植體無菌處理將蜈蚣草幼芽用自來水沖洗10分鐘，用3％的質量體積比洗衣粉充分溶解，浸泡幼芽，并不斷攪動，10分鐘后，再用流動的自來水沖洗30分鐘，用吸水紙吸干多余水份置超凈臺上備用。將備用的蜈蚣草幼芽用70％或75％體積比的酒本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用蜈蚣草莖葉勻漿快速獲得其組培苗的方法，包括外植體選擇、外植體無菌處理、蜈蚣草誘導預培養、蜈蚣草誘導培養、蜈蚣草增殖培養基、蜈蚣草分化培養、及蜈蚣草生根培養步驟；其特征在于：a.外植體選用蜈蚣草幼嫩葉片和剛從地下冒出4?6厘米的幼芽；b.蜈蚣草誘導預培養是將幼芽接種到預培養基上形成幼孢子體，預培養基為：1/2MS+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖10g/L，PH5.8?6.0；c.蜈蚣草誘導培養是將幼孢子體和無菌處理好的幼嫩葉片，切成小段，接入誘導培養基上，每皿接種20?25個，置于溫度25.8?26℃，濕度60％?70％的培養箱中暗培養，一周后轉到溫度和濕度與暗培養相同，光照2000Lux，光照時間12小時的培養箱中繼續培養；誘導培養基為：1/2MS+2,4?D?2mg/L+80g/L的蜈蚣草莖干和葉勻漿+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8?6.0；或1/2MS+2,4?D2mg/L+60g/L的蜈蚣草莖干和葉勻漿+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L,PH5.8?6.0；d.蜈蚣草增殖培養是將愈傷組織轉入增殖培養基上，每皿轉接10?15個愈傷組織，此時溫度、濕度、光照條件與愈傷組織誘導培養一致，12天后，愈傷組織長到1?1.5厘米的綠色球狀體；增殖培養基為：1/2MS+2,4?D0.5mg/L+100g/L的蜈蚣草莖干和葉勻漿+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8?6.0；e.蜈蚣草分化培養是兩次分化培養，即：將增殖后的愈傷組織切成0.3?0.5厘米，接入分化培養基中進行分化培養，溫度25.8?26℃，濕度50％?60％，光照強度3000Lux，光照時間12小時，一周后將光照調至4000Lux，出現黃綠色小顆粒，繼續分化培養7天后，綠色顆粒隨著長大，并長出芽點和纖細小苗，為第一次分化，分化培養基為：1/2MS+6?BA2mg/L+NAA0.2mg/L+120g/L的蜈蚣草莖干和葉勻漿+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8?6.0；接著又將光照調回3000Lux，將長出的芽點和纖細小苗，重新接入新的分化培養基中繼續進行分化培養，7天后，分化的芽點已經長成獨立小苗同時又長出新的叢生芽點和新的愈傷，這個周期為第二次分化培養，分化培養基為：1/2MS+6?BA1mg/L+NAA0.2mg/L+200g/L的蜈蚣草莖干和葉勻漿+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8?6.0；f.生根培養是指將綠而壯的小苗接入生根培養基中生根培養，將3?4厘米綠而壯的小苗接入裝有30毫升生根培養基的玻璃試管中，溫度25.8?26℃，濕度50％?60％，光照強度3000Lux，光照時間12小時，進行生根培養，15?20天后，根芽長出，27天后，主根長2厘米，此時的生根苗即能假植；生根培養基為：1/4MS+NAA0.2mg/L+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖15g/L，PH5.8?6.0。...

【技術特征摘要】
1.一種利用蜈蚣草莖葉勻漿快速獲得其組培苗的方法，其特征在于利用蜈蚣草莖葉勻漿快速獲得其組培苗的方法的具體步驟如下：a.外植體選用蜈蚣草幼嫩葉片和剛從地下冒出4-6厘米的幼芽；b.蜈蚣草誘導預培養是將幼芽接種到預培養基上形成幼孢子體，預培養基為：1/2MS+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖10g/L，PH5.8-6.0；c.蜈蚣草誘導培養是將幼孢子體和無菌處理好的幼嫩葉片，切成小段，接入誘導培養基上，每皿接種20-25個，置于溫度25.8-26℃，濕度60％-70％的培養箱中暗培養，一周后轉到溫度和濕度與暗培養相同，光照2000Lux，光照時間12小時的培養箱中繼續培養；誘導培養基為：1/2MS+2,4-D2mg/L+80g/L的蜈蚣草莖干和葉勻漿+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0；或1/2MS+2,4-D2mg/L+60g/L的蜈蚣草莖干和葉勻漿+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L,PH5.8-6.0；d.蜈蚣草增殖培養是將愈傷組織轉入增殖培養基上，每皿轉接10-15個愈傷組織，此時溫度、濕度、光照條件與愈傷組織誘導培養一致，12天后，愈傷組織長到1-1.5厘米的綠色球狀體；增殖培養基為：1/2MS+2,4-D0.5mg/L+100g/L的蜈蚣草莖干和葉勻漿+瓊脂粉7.8g/L+蔗糖20g/L，PH5.8-6.0；e.蜈蚣草分化培養是兩次分化培養，即：...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王玲仙，陳玲，程在全，曾民，李維蛟，付堅，王波，陳越，鐘巧芳，李定琴，柯學，殷富有，張敦宇，蔣聰，蔣春苗，羅紅梅，肖素勤，楊雅云，
申請(專利權)人：云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，
類型：發明
國別省市：云南;53