【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種檢測動物胃微生物的方法，特別是。
技術(shù)介紹
高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing)又稱“下一代”測序技術(shù)(〃Next_generat1n〃sequencing technology)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測序原理和技術(shù)不同等，主要有以下幾種:大規(guī)模平行簽名測序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(PolonySequencing)、454 焦磷酸測序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa) sequencing、ABISOLiD sequencing、離子半導(dǎo)體測序(1n semiconductor sequencing)、DNA 納米球測序(DNA nanoball sequencing)等。第一、第二代測序技術(shù)測序時間長，測量結(jié)果不夠精確，測序通量較低，操作較為復(fù)雜。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是要提供一種快速、全面的檢測荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法，幫助人們了解荷斯坦奶牛瘤胃中的微生物種類和數(shù)量，尤其是對不可培養(yǎng)的瘤胃微生物有了較全面的認(rèn)識。本專利技術(shù)是按如下技術(shù)方案實現(xiàn)的:提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通過測序確定其微生物種類及相對數(shù)量；按如下操作步驟制備:(I)基因組DNA抽提:提取荷斯坦奶牛瘤胃液然后進(jìn)行微生物DNA組的提取純化，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA ;(2)聚合酶鏈?zhǔn)?span style='display:none'>反應(yīng)擴(kuò)增:按指定測序區(qū)域，合成帶有條形碼的特異引物；將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用基因組DNA小量試劑盒凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，三氨基甲烷洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；全部樣品按照正式實驗條件進(jìn)行，每個樣品3個重復(fù)；(3)熒光定量:參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用熒光計藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合；(4)高通量測序平臺文庫構(gòu)建，按以下步驟進(jìn)行:①連接“Y”字形接頭；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；④氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段；(5)高通量測序平臺測序，按以下步驟進(jìn)行:①DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；②另一端隨機(jī)與附近的另外一個引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋(bridge)”；③聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；④DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈；⑤加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸，每次循環(huán)只合成一個堿基；生成“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”；⑥用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；⑦將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3’端粘性即非平末端，繼續(xù)聚合第二個核苷酸；⑧統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列；(6)生物信息分析高通量測序平臺測序得到的首尾讀長首先根據(jù)重疊部分關(guān)系進(jìn)行拼接，同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣品后進(jìn)行波長轉(zhuǎn)換器聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于波長轉(zhuǎn)換器可以進(jìn)行物種多樣性指數(shù)分析，基于波長轉(zhuǎn)換器聚類分析結(jié)果，可以對波長轉(zhuǎn)換器進(jìn)行物種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學(xué)信息，可以在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析；(7)測序結(jié)果:確定荷斯坦奶牛瘤胃所有微生物的種類相對數(shù)量。有益效果，由于采用了上述方案，結(jié)果能夠快速，全面，高效的檢測荷斯坦奶牛瘤胃微生物的種類及數(shù)量，以便人們對其瘤胃微生物種類及數(shù)量的分析，研宄瘤胃微生物對其攝取營養(yǎng)的吸收消化機(jī)制。解決了測序時間長，效率低，結(jié)果精確度低，測序結(jié)果不全面等問題達(dá)到了本專利技術(shù)的目的。優(yōu)點:該方法能夠減少檢測時間，檢測結(jié)果精確全面，能夠準(zhǔn)確測出荷斯坦奶牛瘤胃中所有微生物的種類及相對數(shù)量?！靖綀D說明】:圖1是本專利技術(shù)的制備方法流程圖。圖2是本專利技術(shù)的六頭荷斯坦奶牛瘤胃屬水平下的微生物的種類及相對數(shù)量圖。圖3是六頭荷斯坦奶牛瘤胃目水平下的微生物的種類及相對數(shù)量圖?！揪唧w實施方式】下面結(jié)合實例對本專利技術(shù)進(jìn)一步描述實施例1:本專利技術(shù)的方法為:提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通過測序確定其微生物種類及相對數(shù)量；按如下操作步驟制備:(I)基因組DNA抽提:提取荷斯坦奶牛瘤胃液然后進(jìn)行微生物DNA組的提取純化，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA ;(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):按指定測序區(qū)域，合成帶有條形碼的特異引物；將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用基因組DNA小量試劑盒凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，三氨基甲烷洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；全部樣品按照正式實驗條件進(jìn)行，每個樣品3個重復(fù)；所述的條形碼英文表達(dá)barcode ;所述的基因組DNA小量試劑盒英文表達(dá)AxyPr印DNA ;所述的三氨基甲烷英文表達(dá)TrisJlCl ;所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)英文表達(dá) PCR ；(3)熒光定量:參照電泳初步定量結(jié)果，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物用熒光計藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合；所述的熒光計的型號為TBS-380，英文表達(dá)QuantiFluor?-ST ；(4)高通量測序平臺文庫構(gòu)建，按以下步驟進(jìn)行:①連接“Y”字形接頭；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；當(dāng)前第1頁1 2 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種檢測荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法，其特征是：提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通過測序確定其微生物種類及相對數(shù)量；按如下操作步驟制備：（1）基因組DNA?抽提：提取荷斯坦奶牛瘤胃液然后進(jìn)行微生物DNA組的提取純化，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA；（2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增：按指定測序區(qū)域，合成帶有條形碼的特異引物；將同一樣品的PCR?產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用基因組DNA小量試劑盒凝膠回收試劑盒切膠回收PCR?產(chǎn)物，三氨基甲烷洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；全部樣品按照正式實驗條件進(jìn)行，每個樣品3個重復(fù)；（3）熒光定量：參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR?產(chǎn)物用熒光計藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合；（4）高通量測序平臺文庫構(gòu)建，按以下步驟進(jìn)行：①連接“Y”字形接頭；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；④氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段；（5）高通量測序平臺測序，按以下步驟進(jìn)行：①?DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；②另一端隨機(jī)與附近的另外一個引物互補(bǔ)，也被固定...
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王秀穎，朱春婷，溫洪宇，
申請(專利權(quán))人：江蘇師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32
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