檢測(cè)遺傳變異的系統(tǒng)和方法技術(shù)方案

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供了用于對(duì)一個(gè)或多個(gè)樣品中的特定靶序列進(jìn)行高通量擴(kuò)增測(cè)序的方法、裝置和組合物。在一些方面，對(duì)條形碼標(biāo)記的多核苷酸進(jìn)行同時(shí)測(cè)序，以及基于條形碼序列鑒定樣品來(lái)源。在一些方面，將測(cè)序數(shù)據(jù)用于測(cè)定一個(gè)或多個(gè)包含致病性遺傳變體的基因座的一個(gè)或多個(gè)基因型。在一些方面，提供了檢測(cè)遺傳變異的系統(tǒng)和方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】【專(zhuān)利說(shuō)明】 專(zhuān)利技術(shù)背景 下一代測(cè)序（NGS)允許小型、廉價(jià)的基因組測(cè)序，其周轉(zhuǎn)時(shí)間以天計(jì)算。然而，正 如對(duì)NGS的一般執(zhí)行和理解，基因組的所有區(qū)域以大致相等的概率被測(cè)序，這意味著大量 的基因組序列被收集并棄去，以收集來(lái)自相對(duì)低的百分比的區(qū)域的序列信息，在所述區(qū)域 中功能已被充分了解，足以詮釋潛在突變。一般而言，作為與測(cè)序分開(kāi)的步驟，僅從全基因 組樣品純化那些人們感興趣的區(qū)域。其在當(dāng)前技術(shù)水平上通常是持續(xù)數(shù)天的低效方法。 直接靶向測(cè)序（DTS)是對(duì)一個(gè)由Illumina公司采用的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方案的修改，其還 允許測(cè)序基板（即流動(dòng)池）成為基因組序列捕獲基板。由于不向典型的下一代測(cè)序方案的 正常流程添加另一個(gè)儀器，因此DTS方案修改測(cè)序表面以從專(zhuān)門(mén)制備的文庫(kù)捕獲gDNA。隨 后如對(duì)正常gDNA文庫(kù)一樣對(duì)捕獲的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。然而，測(cè)序基板和根據(jù)先前建議的伴隨 文庫(kù)制備的修改導(dǎo)致低效率，降低的可靠性和可重復(fù)性，并且浪費(fèi)寶貴的樣品。因此期望改 進(jìn)DTS過(guò)程。 專(zhuān)利技術(shù)概述 在一個(gè)方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供了用于對(duì)多個(gè)靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的裝置和制造裝置方 法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括：(a)提供具有反應(yīng)性表面的固體載體；以及（b)將多 個(gè)寡核苷酸附接于固體載體。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)寡核苷酸包括：（i)多個(gè)不同的 包含序列A和序列B的第一寡核苷酸，其中序列A在所有第一寡核苷酸中是共同的；并且另 外地其中序列B對(duì)于每一個(gè)不同的第一寡核苷酸是不同的，位于每一個(gè)第一寡核苷酸的3' 末端，并且與包含致病性遺傳變體的序列或致病性遺傳變體的200個(gè)核苷酸內(nèi)的的序列互 補(bǔ)；（ii)多個(gè)在各自的3'端包含序列A的第二寡核苷酸；和（iii)多個(gè)在各自的3'端包 含序列C的第三寡核苷酸，其中序列C與由多個(gè)不同的靶多核苷酸共享的序列相同。在一 些實(shí)施方案中，A、B和C是不同的序列，并且各自包含5個(gè)或更多個(gè)核苷酸。 在一些實(shí)施方案中，序列A、B和C彼此具有低于90%的序列同一性。在一些實(shí)施 方案中，所述多個(gè)寡核苷酸包含反應(yīng)性部分，以便反應(yīng)性表面與反應(yīng)性部分之間的反應(yīng)將 所述多個(gè)寡核苷酸附接于固體載體。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)第一寡核苷酸包含至少約100 個(gè)不同的各自包含不同的序列B的第一寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)第一寡核苷酸 的一個(gè)或多個(gè)的序列B包含選自圖4中顯示的SEQ ID NO 22-121的序列。在一些實(shí)施方 案中，固體載體是流動(dòng)池的通道。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)性表面包含官能化聚丙烯酰胺， 其可從包含丙烯酰胺、N-(5-溴乙酰氨基戊基）丙烯酰胺、四甲基乙二胺和過(guò)硫酸鉀的聚合 混合物產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)第二寡核苷酸的量比多個(gè)第一寡核苷酸的量高至少 約1000倍或10000倍；并且多個(gè)第二寡核苷酸的量與多個(gè)第三寡核苷酸的量以約1:1的比 率存在。在一些實(shí)施方案中，將第一寡核苷酸的每一個(gè)以約50pM的濃度添加至固體載體。 在一些實(shí)施方案中，多個(gè)第二寡核苷酸和多個(gè)第三寡核苷酸的濃度為約500nM。在一些實(shí)施 方案中，本專(zhuān)利技術(shù)提供了對(duì)多個(gè)靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法，所述方法包括將根據(jù)本專(zhuān)利技術(shù)的 方法產(chǎn)生的裝置暴露于包含靶多核苷酸和非靶多核苷酸的樣品，其中相對(duì)于非靶基因組序 列富集靶基因組序列的測(cè)序數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)不同的第一寡核苷酸還包括包 含序列A和序列B的另外的第一寡核苷酸，其中序列B對(duì)于每一個(gè)不同的另外的第一寡核 苷酸是不同的，位于每一個(gè)另外的第一寡核苷酸的3'末端，并且與包含非主題序列的序列 或非主題序列的200個(gè)核苷酸內(nèi)的序列互補(bǔ)。 在一個(gè)方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供了用于對(duì)樣品中的多個(gè)靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括：(a)對(duì)靶多核苷酸進(jìn)行片段化以產(chǎn)生片段化多核苷酸； (b)將銜接頭寡核苷酸連接于片段化多核苷酸，每一個(gè)銜接頭寡核苷酸包含序列D，以產(chǎn)生 銜接頭連接的多核苷酸，其在所述銜接頭連接的多核苷酸的兩個(gè)末端包含與互補(bǔ)序列D'雜 交的序列D，任選地其中序列D'通過(guò)靶多核苷酸3'末端的延伸產(chǎn)生；（c)使用包含序列C、 序列D和與樣品相關(guān)的條形碼的擴(kuò)增引物擴(kuò)增適合的多核苷酸，其中序列D位于擴(kuò)增引物 的3'末端；（d)將經(jīng)擴(kuò)增的靶多核苷酸與附接于固體表面的多個(gè)不同的第一寡核苷酸雜 交；（e)在固體表面上進(jìn)行橋擴(kuò)增；和（f)對(duì)來(lái)自步驟（e)的多個(gè)多核苷酸進(jìn)行測(cè)序。固體 表面可包含多個(gè)本文中描述的寡核苷酸，包括本文中描述的和任選地按照本文中描述的方 法產(chǎn)生的裝置。在一些實(shí)施方案中，固體表面包含（i)多個(gè)不同的包含序列A和序列B的 第一寡核苷酸，其中序列A在所有第一寡核苷酸中是共同的；并且另外地其中序列B對(duì)于每 一個(gè)不同的寡核苷酸是不同的，位于每一個(gè)第一寡核苷酸的3'末端，并且與包含致病性遺 傳變體的序列或致病性遺傳變體的200個(gè)核苷酸內(nèi)的序列互補(bǔ)；（ii)多個(gè)第二寡核苷酸， 所述寡核苷酸在各自的3'末端包含序列A ;和（iii)多個(gè)第三寡核苷酸，所述寡核苷酸在 各自的3'末端包含序列C。在一些實(shí)施方案中，序列A、B和C是不同的序列并且各自包含 5個(gè)或更多個(gè)核苷酸。 在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在步驟（d)之前包括第二擴(kuò)增步驟，其中使 用第二擴(kuò)增引物擴(kuò)增經(jīng)擴(kuò)增的多核苷酸，所述引物具有包含與在步驟（c)中添加至靶多核 苷酸的一個(gè)或多個(gè)序列的至少一部分互補(bǔ)的序列的3'末端。在一些實(shí)施方案中，序列A、B 和C彼此具有小于90%的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)第一寡核苷酸包含至少約 100個(gè)不同的各自包含不同的序列B的第一寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)第一寡核苷 酸的一個(gè)或多個(gè)的序列B包含選自SEQ ID NO 22-121的序列，如圖4中所示的。在一些實(shí) 施方案中，每一個(gè)條形碼與一池兩個(gè)或更多個(gè)樣品中的每一個(gè)其它條形碼在至少3個(gè)核苷 酸位置上相異。在一些實(shí)施方案中，將樣品混合，以使所有四個(gè)核苷酸堿基A、G、C和T大 致均勻地出現(xiàn)在沿著池中的每一個(gè)條形碼的每一個(gè)位置上。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多 個(gè)條形碼選自 AGGTCA、CAGCAG、ACTGCT、TAACGG、GGATTA、AACCTG、GCCGTT、CGTTGA、GTAACC、 CTTAAC、TGCTAA、GATCCG、CCAGGT、TTCAGC、ATGATC 和 TCGGAT。在一些實(shí)施方案中，條形碼位 于序列C與序列D之間。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括基于條形碼序列鑒定靶多核 苷酸所源自的樣品的步驟。在一些實(shí)施方案中，片段化多核苷酸具有約200至約1000個(gè)堿 基對(duì)的中值長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，步驟（f)包括（i)通過(guò)延伸與位于條形碼3'的位置 雜交的第一測(cè)序引物進(jìn)行的測(cè)序；和隨后（ii)通過(guò)延伸與位于條形碼的5'的位置雜交的 第二測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，固體載體為流動(dòng)池的通道。在一些實(shí)施方案 中，利用自動(dòng)化系統(tǒng)例如處理機(jī)（例如Biomek FXP)進(jìn)行步驟（b)和（c)。在一些實(shí)施方案 中，利用自動(dòng)化系統(tǒng)例如包含cBot機(jī)器的系統(tǒng)進(jìn)行步驟（d)。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行步驟 (d)的自動(dòng)化系統(tǒng)也進(jìn)行步驟（e)。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生至少約100個(gè)不同的靶多核苷 酸的測(cè)序數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，步驟（d)在單個(gè)流動(dòng)池中使用至少本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種產(chǎn)生用于對(duì)多個(gè)靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的裝置的方法，所述方法包括：(a)提供具有反應(yīng)性表面的固體載體；和(b)將多個(gè)寡核苷酸附接于固體載體；其中所述多個(gè)寡核苷酸包含(i)多個(gè)不同的第一寡核苷酸，其包含序列A和序列B，其中序列A在所有第一寡核苷酸中是共同的；并且另外地其中序列B對(duì)于每一個(gè)不同的第一寡核苷酸是不同的，位于每一個(gè)第一寡核苷酸的3’末端，并且與包含致病性遺傳變體的序列或致病性遺傳變體的200個(gè)核苷酸內(nèi)的序列互補(bǔ)；(ii)多個(gè)第二寡核苷酸，其在各自的3’末端包含序列A；和(iii)多個(gè)第三寡核苷酸，其在各自的3’末端包含序列C，其中序列C與由多個(gè)不同的靶多核苷酸共享的序列相同；其中序列A、B和C是不同的序列并且各自包含5個(gè)或更多個(gè)核苷酸。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：H理查茲，E埃文斯，巴拉吉斯里尼瓦桑，薩布拉曼亞姆斯里尼瓦桑，A沙，AS帕特森，C查，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：考希爾股份有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：美國(guó);US