一種雛鵝病毒性肝炎抗體及制備方法和應用技術

一種雛鵝病毒性肝炎抗體及制備方法和應用，屬于獸用抗體制備領域，它包括楊樹皮類脂0.3～0.5％(重量百分比)，鵝源鴨甲型肝炎基因3型病毒高免卵黃抗體，中和效價不低于1：128，泊羅沙姆1880.1～0.2％(重量百分比)，硫柳汞0.01％(重量百分比)。本發明專利技術抗體具有取材方便、分離純化方法簡單、產量高，同時具有特異性高、穩定性較好的有點，同時還具有產生免疫力時間早：注射鵝體后1小時即可產生堅強免疫力，比常規抗體提前2小時左右；保存運輸方便：無需特殊冷藏設備，0～8℃保存12個月，常溫6個月；應激性小，吸收良好。在緊急預防與治療雛鵝感染鴨甲型肝炎基因3型病毒引起的雛鵝病毒性肝炎方面具有顯著的效果。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于獸用抗體制備領域，具體地涉及一種雛鵝病毒性肝炎抗體及制備方法 和應用。
技術介紹
多流行于冬春季的鴨甲型肝炎病毒（Duck H印atitis A Virus ;DHAV)，是一種鴨 急性接觸性傳播性病毒，1~2周雛鴨最易感。DHAV從基因型可分為1，2, 3型，引起雛鴨發 病的主要為1，3型病毒。DHAV主要導致雛鴨運動失調、轉圈、兩腳痙攣后踢，頭向后背等神 經癥狀，該病發病急，傳播快，雛鴨常在發病后幾個小時內死掉。近年來，有研宄報道雛鵝 發生病毒性肝炎，但由于病因復雜，尚未有明確的報道確定鵝的病毒性肝炎病原是鴨甲型 肝炎病毒，對該病原也沒有進行分類研宄的報道。我們先前研宄證明，從發病小鵝瘟的雛鵝 肝臟中分離獲得的病原為鴨甲型肝炎病毒基因3型，從而將該病原予以明確，并在此基礎 上研宄發現該病毒基因3型也能夠感染雛鵝，導致1~2周齡雛鵝發病并且死亡，且流行病 學調查表明，發生小鵝瘟的雛鵝攜帶該病毒的陽性率較高，達到20~30%。 傳統上，防治鴨甲型肝炎的方法是使用鴨肝炎抗體。通過利用滅活的鴨甲型肝炎 疫苗對產蛋雞進行多次免疫，可獲得安全、高效的卵黃抗體。但是，尚沒有文獻報道對鵝源 鴨甲型肝炎基因3型病毒感染雛鵝是如何進行治療和預防的，也未見有制備相應的抗體的 報道。 產蛋雞易于規模化飼養，產蛋率高，是大批量生產卵黃抗體的理想動物。應用異源 動物雞制備卵黃抗體，不但減少了同源疫病傳染的危險，也為研制其他疫病的異源高免卵 黃抗體提供了有益的經驗。 卵黃抗體是指從免疫禽蛋中提取出的針對特定抗原的抗體，由于卵黃中僅有IgG 類抗體，故稱其為卵黃免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins),簡稱為IgY。卵黃抗體 的研宄始于19世紀末，1893年，Klemperer發現了卵黃中富含抗體；1934年Jukes的實驗 證明母雞血清中的抗體可以轉移到卵黃中，從而為雛雞提供被動免疫保護。Patters等的試 驗證實，相對別的血漿蛋白，IgG被選擇性的轉運到卵泡中。1969年，Leslie和Clem將這 種抗體命名為IgY。 卵黃抗體的形成過程是：當機體受到外界特異性抗原（尤其是滅活抗原）的刺激 后誘發一系列的免疫應答反應，激發B細胞分化成能分泌特異性抗體的漿細胞，分泌大量 的特異性抗體進入血液中。同時在產蛋禽體內，血液中的特異性抗體IgG (所有亞群）由卵 巢IgG受體的介導逐步進入到卵巢濾泡和輸卵管中，并在卵黃中蓄積起來，也正是由于這 種卵黃累積作用，使卵黃中的IgG明顯地高于血清中的含量，而血清中的其他抗體（主要是 IgM，IgA)與輸卵管中的卵白白蛋白一起混入到雞蛋白中。 卵黃抗體在多種環境中有較高的穩定性，在低于75°C條件下，卵黃抗體具有良好 的熱穩定性，90°C處理15min后，大部分卵黃抗體喪失結合活性，在pH < 4時，僅有少量卵 黃抗體失去活性。在PH4-12范圍內，卵黃抗體的結合活性幾乎不受影響，在pH > 12時，卵 黃抗體迅速失去結合活性。實驗表明，卵黃抗體具有耐受反復凍融的特性，即使經過5次凍 融，其抗原結合活性幾乎不受影響。在室溫下可保存6個月，4°C保存可達5年以上，活性僅 下降5%左右。由于具有這些穩定的理化性質，所以其的開發應用備受人們所關注。 除上述理化特性外，卵黃抗體還有其他重要的生物學特性。卵黃抗體濃度高于血 清IgG，單個卵黃（約15mL)含200mg左右的卵黃抗體，自卵黃中獲得卵黃抗體較實驗動物 血清方便。且卵黃抗體不與哺乳動物補體、Fc受體結合，也不與葡萄球菌蛋白A(SPA)或鏈 球菌蛋白G(SPG)結合，卵黃抗體還不與血清中的類風濕因子（RF)結合，可提高免疫學檢測 的準確性。因而可用卵黃抗體檢測糞便中的病毒，因為糞便中經常含有大量SPA，用卵黃抗 體檢測可避免假陽性結果。卵黃抗體是獨特的IgG同種型抗體，同時哺乳動物組織結構較 禽類組織具有高度免疫性，卵黃抗體用于哺乳動物檢測具有明顯的優勢，許多高度保守的 抗原，在免疫動物后僅產生極小的免疫原性，卻可用卵黃抗體進行區分，因此卵黃抗體可用 于獸醫和人類免疫學的檢測。 楊樹皮類脂（Poplar Bark Lipid，PBL)是從楊樹皮中提取的一種橙黃色脂溶性物 質，是一種天然的復雜混合物，富含大量的多糖、有機酸、留醇、磷脂、甙類及維生素等物質。 多糖類具有促胸腺體液反應、刺激網狀內皮系統，提高機體特異性免疫反應能力；有機酸具 有增強機體免疫功能的作用，能夠刺激和促進單核吞噬細胞功能，對抗免疫抑制對免疫器 官的抑制作用；甙類能夠加速抗體的產生、促進淋巴細胞轉化和增強網狀內皮系統功能等 作用。這些物質在動物體內協調統一，大大提高動物體的免疫機能。通過免疫反應切片觀 察注射過楊樹皮類脂的家禽主要免疫器官如法氏囊、胸腺、脾臟、盲腸和扁桃體等產生了強 烈的免疫應答反應。因此，可以確定楊樹皮類脂具有較強的免疫增強作用。這些機理的研 宄，為楊樹皮類脂協助抗體用于預防和治療某些家禽疫病提供了理論支持。 對于楊樹皮類脂的免疫效果，我們前期研宄證明，楊樹皮類脂作為提高機體免疫 力的免疫增強劑，也受到劑量的嚴格影響，其免疫誘導作用具有雙向性。適量的劑量具有正 向的免疫增強作用，楊樹皮類脂的添加劑量影響著機體免疫器官的應答反應程度。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題在于提供一種雛鵝病毒性肝炎抗體，以及該抗體的制備 方法和應用領域。利用楊樹皮類脂與鵝源鴨甲型肝炎基因3型病毒高免卵黃抗體進行混 合，制備出用于預防和治療雛鵝感染鴨甲型肝炎基因3型病毒而導致的雛鵝病毒性肝炎的 卵黃抗體。 本專利技術是通過如下技術方案來實現的： 一種雛鵝病毒性肝炎抗體，它包括楊樹皮類脂0. 1~0. 3% (重量百分比），鵝源 鴨甲型肝炎基因3型病毒高免卵黃抗體，中和效價不低于1 :128,泊羅沙姆1880. 1~0. 2% (重量百分比），硫柳汞0.01% (重量百分比）。 本專利技術還提供一種雛鵝病毒性肝炎抗體的制備方法，步驟如下： (1)制備卵黃抗體，按照不低于1 :4的體積比例混合卵黃抗體和無菌生理鹽水，進 行勻楽·； (2)在步驟（1)得到的混合液中添加楊樹皮類脂，使其終濃度達到0. 1~0. 3% (重量百分比），充分混合攪拌； (3)在步驟（2)得到的上述混合液中添加泊羅沙姆188,使其終濃度達到0. 1~ 0.2% (重量百分比）； (4)將步驟（3)得到的混合液在4~8°C冷浸過濾； (5)步驟（4)得到的濾液經巴氏消毒后加入終濃度為0.01% (重量百分比）的硫 柳汞，分裝，無菌檢驗合格備用。 進一步，所述的步驟（1)卵黃抗體的制備方法：利用鵝源鴨甲型肝炎基因3型毒株 接種SPF鴨胚或非免疫鴨胚或鵝胚，收集60~120小時死亡胚胚體、絨毛膜和尿囊液混合 搗碎，凍融三次，離心，取上清液，加終濃度為0.1% (重量百分比）的甲醛滅活；然后與油 佐劑充分乳化制成油乳劑滅活疫苗，用于健康產蛋雞的免疫；首次免疫每只雞胸部肌肉注 射0. 5ml弱毒疫苗，14日后進行第二次免疫，每只雞胸部肌肉注射1.0 ml油乳劑滅活苗，21 日時進行第3次免疫，每只雞肌肉注射1.0 ml油乳劑滅活苗，28日時進行第本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種雛鵝病毒性肝炎抗體，其特征在于它包括楊樹皮類脂0.1～0.3％(重量百分比)，鵝源鴨甲型肝炎基因3型病毒高免卵黃抗體，中和效價不低于1：128，泊羅沙姆1880.1～0.2％(重量百分比)，硫柳汞0.01％(重量百分比)。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張興曉，侯艷霞，王秀云，張麗娜，李文超，
申請(專利權)人：魯東大學，
類型：發明
國別省市：山東;37