可特異性結合玉米赤霉烯酮的多肽分子及其應用制造技術

可特異性結合玉米赤霉烯酮的多肽分子及其應用。本發明專利技術屬于生物技術領域，涉及可特異性結合玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)的多肽分子及其應用，該多肽分子的氨基酸序列為MTPTRSRQLLLR。本發明專利技術采用磁珠液相親和淘選并結合ZEN抗體競爭性洗脫的方式，快速淘選獲得可特異性結合ZEN的多肽分子，所述的多肽分子可以替代傳統的ZEN抗體并應用于ZEN的免疫學分析體系中，其線性檢測范圍寬廣，該多肽分子的獲得無需免疫過程、制備簡單、成本低、周期短，該多肽分子既可通過生物培養的方式大量擴增，也可以通過化學合成或者基因工程的方法進行大量制備，為ZEN抗體的制備提供了新的路徑，具有較好的應用價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體涉及可特異性結合玉米赤霉烯酮的多肽分子及其 應用。
技術介紹
玉米赤霉稀酮（Zearalenone，ZEN)是由鐮刀菌產生的一種類雌激素樣真菌毒素， 其化學名為6-(10-羥基-6氧基-十一碳烯基）β -雷鎖酸內酯，廣泛存在于霉變的玉米、 高粱、小麥、燕麥、大麥等谷類作物以及奶中。禾谷鐮刀菌是產生ZEN的主要菌屬，此外為三 線鐮刀菌、木賊鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、粉紅鐮刀菌等，由于ZEN在谷物糧食中污染普遍，可通 過食物鏈的作用對家禽及人體健康產生毒害作用，因此對ZEN的監測就顯得尤為重要。 目前比較常用的檢測ZEN的方法主要包括：高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC)，氣相色譜法（Gaschromatography，GC)，薄層層析法（Thin layer chromatography，TLC)，高效液相色譜-質譜聯用法（High performance liquid chromatography-mass sepectrum，HPLC-MS)，微生物檢測法和免疫檢測法等，其中免疫學 分析方法以其靈敏度高、操作簡單以及可實現規?；Y選等優點，在ZEN的快速檢測領域 中得到了廣泛的應用。 免疫學分析方法的核心在于抗原-抗體間的特異性識別及結合，因此制備特異性 結合抗原的抗體就成為發展免疫學分析方法的前提與核心。抗體的研宄近年來發展迅猛， 已經從傳統的多克隆、單克隆抗體，發展至以單鏈抗體、噬菌體展示抗體、單域重鏈抗體、抗 獨特型抗體等為代表的基因工程抗體領域。相比于傳統抗體制備必須經歷動物免疫、細胞 融合、陽性克隆篩選等復雜程序，基因工程抗體以其可定向改造、淘選方便等優點已成為目 前研宄的熱點。除此以外，近年來包括我國在內的眾多學者已經開始著眼于不以免疫球蛋 白為主體組成結構的新型抗體研宄，例如基于SELEX技術的核酸適配體、基于分子印跡聚 合體技術的人工抗體以及基于Lipocalin蛋白家族的抗體類似物等都取得了可喜的進展， 為傳統抗體的替代性研宄提供了扎實的理論和方法學基礎?？v觀抗體的發展動態，可以 看出新型抗體具有分子量小、結構簡單、可自我進化、制備快捷的特點及發展趨勢。例如， 單克隆抗體、單鏈抗體、單域重鏈抗體的分子量逐漸減少，分別為150、30-50、15-20kDa，以 Lipocalin為骨架蛋白的抗體類似物為18-20kDa，而核酸適配體則僅為一小段核酸序列。 近年來人們熱衷于研宄發展肽模擬物（peptido-mimetics)，目的之一是將具有生 物活性的復雜分子逐步修飾、取代、改造、最終壓縮至僅包含功能單位的小分子，稱之為肽 模擬物的合理設計。因此，多肽分子可成為潛在的新型抗體分子。隨著噬菌體展示多肽庫技 術的迅速發展，通過噬菌體展示肽庫的淘選，可快速、簡單地獲得與特定靶體分子特異性結 合的多肽分子。噬菌體展示肽庫技術的主要特點是可有效地篩選出與目標靶體特異結合的 噬菌體展示多肽，該技術在探索受體與配體之間相互作用結合位點、尋求高親和力生物活 性的配體分子、探索未知蛋白質空間結構表位、新型疫苗的研制等方面應用廣泛，但是上述 噬菌體展示多肽技術的應用大多局限于以大分子蛋白質為靶體分子進行親和淘選。由于蛋 白質表面具有多個拷貝的表位，因此非常容易獲得與之對應結合的多肽分子。目前的多肽 分子大多作為抗原的模擬表位（抗原替代物）應用于免疫學分析中，而將多肽分子作為小 分子物質抗體的替代物應用于免疫學分析的報道較少，其原因在于，小分子物質體積過小， 且表面沒有豐富的氨基、羧基基團，難以與多肽分子結合，從而造成淘選困難。 本專利技術通過噬菌體展示多肽庫技術，采用磁珠液相親和淘選并結合ZEN抗體競爭 性洗脫的方式，從噬菌體展示多肽庫中快速篩選到能與ZEN特異性結合的多肽分子，該多 肽分子具有與傳統的 ZEN單克隆抗體分子相似的免疫學檢測特性，且線性檢測范圍寬廣， 可作為傳統ZEN抗體的替代物應用于ZEN的免疫學分析體系。該方法避免了制備傳統的單 克隆抗體分子所需要經過周期長的免疫過程、細胞融合、單克隆篩選等流程，具有無需免疫 過程、篩選方便、周期短、制備成本低等特點。
技術實現思路
本專利技術以ZEN全抗原（ZEN與牛血清白蛋白的偶聯物ZEN-BSA)為靶分子，將 靶分子結合到磁珠上，投入噬菌體隨機展示十二肽庫，進行磁珠液相親和淘選，結合ZEN 抗體競爭性洗脫的方式，獲得了一種可特異性結合ZEN的多肽分子，其氨基酸序列為： MTPTRSRQLLLR。 上述多肽分子結構中，大寫英文字母分別代表已知天然L-型氨基酸殘基或其 D-型異構體的一種，即M代表蛋氨酸殘基，T代表蘇酸殘基，P代表脯氨酸殘基，R代表精氨 酸殘基，S代表絲氨酸殘基，Q代表谷氨酰胺殘基，L代表亮氨酸殘基。 本專利技術還涉及編碼上述多肽分子氨基酸序列的核苷酸，其序列為： ATG ACT CCT GAC CGT TCT CGT TAG CTT CTT CTT CGT 本專利技術提及多肽分子可通過噬菌體擴增、化學合成或基因工程重組表達的方式進 行大量制備。噬菌體擴增是指將展示有多肽分子的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖 生產展示有多肽分子的噬菌體粒子?；瘜W合成是指依據公布的模擬表位的氨基酸序列，通 過化學合成多肽的方式進行多肽合成。基因工程重組表達的方式是指將編碼多肽分子的基 因，通過克隆至表達載體，以多肽-融合蛋白的形式進行多肽分子的大量制備。 本專利技術還涉及所述多肽分子在免疫學檢測分析中的應用。免疫學檢測的類型包括 酶聯免疫吸附檢測等基于抗原-抗體特異性反應的免疫學分析檢測類型。 本專利技術的有益效果是：本專利技術所提及的多肽分子可替代傳統的ZEN抗體分子，作 為ZEN的結合分子直接應用于免疫學檢測分析，基于多肽分子的間接競爭ELISA標準曲線 其線性范圍寬廣，該多肽分子具有無需免疫過程、獲取方便、快速、周期短等特點?！靖綀D說明】 圖1基于多肽分子的ZEN間接競爭ELISA標準曲線（線性檢測范圍為l-400ng/ mL)?！揪唧w實施方式】 實施例1.與ZEN特異性結合多肽分子的磁珠液相親和淘選及其鑒定 1)親和淘選與ZEN特異性結合多肽分子的具體方法為：為高效獲得可與ZEN分 子特異性結合的多肽分子，采用了新型的磁珠液相親和淘選并結合ZEN抗體競爭性洗脫 的方式，具體方法為：取〇. 5mg羧基化的磁珠分子（直徑500nm)，用PBST洗滌3次。加 入10 μ L噬菌體隨機展示十二多肽庫（2 X 10npfu，NEB公司），后加入900 μ L PBST，與磁 珠混合，室溫下輕搖震蕩反應30min，磁分離后（此步驟的目的在于去除噬菌體展示肽庫 中與磁珠表面修飾基團結合的多肽分子，這類多肽分子吸附在磁珠表面并通過磁分離而 去除掉），小心吸取上清液（不與磁珠表面修飾基團結合的多肽分子）至另一新離心管， 加入0. 5mg ZEN-BSA偶聯的磁珠（直徑500nm，ZEN-BSA的偶聯量為1.0 mg，ZEN = BSA的偶 聯比為 20:1，偶聯物的制備方法參見 Burkin ea al·，2000, Applied biochemistry and本文檔來自技高網...

【技術保護點】
可特異性結合玉米赤霉烯酮的多肽分子，其特征在于其氨基酸序列為:MTPTRSRQLLLR。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：何慶華，許楊，
申請(專利權)人：南昌大學，
類型：發明
國別省市：江西;36