微泡菌屬細菌生物合成對羥基苯甲酸和酯類的方法技術

一種微泡菌生物合成對羥基苯甲酸和酯類的方法。對羥基苯甲酸是合成液晶等用途廣泛的有機合成原料，其酯類有抑菌活性，作為防腐劑廣泛應用于食品和化妝品的保存上。我們從海洋中發現一種擁有天然合成對羥基苯甲酸和酯類的微泡菌。該菌株培養液中對羥基苯甲酸的最終積累濃度為10mM。合成的酯類包括對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、庚酯和壬酯，各個的合成量大約是2mM。為了獲得對羥基苯甲酸，在海水培養基中加入2％葡萄糖培養A4B菌株至穩定期，用鹽酸調成酸性后乙酸乙酯萃取可得。在中性條件下萃取培養液可獲得酯類。利用該細菌可以從可再生資源生物合成工業原料的對羥基苯甲酸和其酯類，可降低人類對石化資源的過分依賴。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種合成對羥基苯甲酸和酯類的方法，特別是一種微泡菌屬細菌生物 合成對羥基苯甲酸和酯類的方法。
技術介紹
對羥基苯甲酸（4HBA)是用途廣泛的有機合成原料，主要應用于食品、化妝品、醫 藥的防腐、防霉劑和殺菌劑的合成方面。2002年，我國4HBA的生產量為6 000噸，并以每年 11. 4%的速度遞增，預計2014年的生產量可達2萬噸以上。對羥基苯甲酸的用途之一是對 羥基苯甲酸酯類的合成，該酯類化合物的英文名為Paraben，其中甲酯又名為尼泊金甲、乙 酯又名為尼泊金乙，是目前使用最多的防腐劑。對羥基苯甲酸的另外一個重要用途是在合 成液晶高分子上的應用。液晶是在1959年利用對羥基苯甲酸的乙酸酯經熔融和固相聚縮 合后首次獲得，后來經過改良成具有實用價值的材料。現在市場上的液晶商品"Xydar"是 對羥基苯甲酸、對苯二酚和酞酸的聚合物；"X-7G"是4HBA和聚對苯二甲酸乙二酯在熔融狀 態下的聚合物；"Vectra"是對羥基苯甲酸和2-羥基-6-萘甲酸熔融聚合物；"Tian"是對 羥基苯甲酸和2-羥基-6-萘甲酸及對苯二酚的聚合物。 現行的4HBA生產工藝是以石油產物的苯和丙烯出發，在催化劑氯化鋁的存在下 高溫高壓合成異丙苯，然后將異丙苯在80-130°C左右用氧氣氧化成過氧化氫異丙苯。過氧 化氫異丙苯在酸性和60-100°C條件下生成苯酚。從苯酚到4HBA的制備有多種方法。常規 工藝是利用Kolbe-Schmitt反應，即將苯酚加入K0H制備成酚鉀鹽，然后與二氧化碳在高溫 高壓下進行氣固相羧基化反應生成4HBA。整個合成工藝必須在高溫高壓下進行，需要消耗 大量能源導致生產效率低成本高。特別是合成途徑中有環境污染物質苯酚的生成，給工業 排水的處理帶來很大困難。 對羥基苯甲酸的化學結構類似于芳香族氨基酸，在理論上利用生物的芳香族氨基 酸合成途徑，即莽草酸途徑（Shikimatepathway)可以合成對羥基苯甲酸。莽草酸途徑由 7步反應合成分支酸，是普遍存在于植物、真菌和細菌中的一條重要芳香族化合物合成代謝 途徑。第一步是3-脫氧-0 -阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP)合酶催化4-磷酸赤蘚糖和 磷酸烯醇式丙酮酸縮合成DAHP。磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤蘚糖分別是糖酵解途徑和 磷酸戊糖途徑上的重要中間代謝產物。從分支酸到對羥基苯甲酸的合成主要有分支酸裂解 酶途徑和苯丙素途徑。分支酸裂解酶途徑由分支酸裂解酶直接催化分支酸生成對羥基苯甲 酸。苯丙素途徑是利用植物合成苯丙素的途徑。從分支酸合成的苯丙氨酸在解氨酶的催化 下，脫掉氨基生成相應的苯丙素，然后和CoA鏈接成對羥基肉桂酸-CoA。對羥基肉桂酸-CoA 裂解酶（HCHL)將對羥基肉桂酸-CoA的側鏈切割掉生成對羥基苯甲醛，最后氧化成對羥基 苯甲酸。HCHL基因在植物中不存在，需要從外源引入才能在植物細胞內打通從苯丙素合成 對羥基苯甲酸的通路。 存在問題： (1)隨著電子信息化社會的不斷發展，對羥基苯甲酸的市場需求量日益增加，現行 的對羥基苯甲酸生產工藝是以石油成分合成而得，在環境污染的不斷惡化、人類的生存已 經面臨威脅之際，利用可再生資源代替以石油為原料的生產工藝已成為全球當務之急。 (2)利用光合作用的植物合成對羥基苯甲酸的最大優點是直接利用二氧化碳，省 去了繁瑣的木質纖維素的糖化過程。但是植物細胞中含有葡糖基轉移酶，將對羥基苯甲酸 葡糖基化或酯化，給下游提純工程帶來困難。另外利用胡蘿卜、甜菜和甘蔗等食物資源生產 工業原料會造成糧食價格的上漲，給社會帶來不安定因素。 (3)目前雖然利用利用重組微生物合成對羥基苯甲酸有一定的研宄進展，但是這 些微生物都是本來不合成積累對羥基苯甲酸的菌株，復雜的改造代謝途徑和反饋調控機制 給對羥基苯甲酸的高效生產帶來局限性。
技術實現思路
本專利技術的目的是要提供一種微泡菌屬細菌生物合成對羥基苯甲酸和對羥基苯甲 酸酯類方法，以解決從可再生資源生物合成對羥基苯甲酸和對羥基苯甲酸酯類的問題。 本專利技術的目的是這樣實現的： a、篩選分離天然合成對羥基苯甲酸和酯類的A4B菌株 制備含有指示菌柱的平板，在液體的人工海水培養基中加入2%的瓊脂，高壓加熱 滅菌后，溫度降到大約50°C，瓊脂凝固之前參入細胞濃度為108/L的B.subtilislml，混勻 后制備成平皿；然后在平皿的中央位置放上一個濾紙片，在濾紙片上滴入待篩選菌株的培 養液；將平皿放在37°C培養箱培養；利用上述方法篩選到一個形成抑菌圈的細菌，即A4B菌 株； 在人工海水培養基中加入2 %的葡萄糖作為碳源培養A4B菌株，然后利用液相 色譜分析了次級代謝產物；A4B菌株合成積累對羥基苯甲酸；A4B菌株還合成了對羥基苯 甲酸甲醋（Methyl4HBA)，對羥基苯甲酸乙醋（Ethyl4HBA)，對羥基苯甲酸丙醋（Propyl 4HBA)，對羥基苯甲酸丁酯（Butyl4HBA)，對羥基苯酸庚酯（Heptyl4HBA)和對羥基苯酸壬 酯（Nonoyl4HBA)，各個的合成量大約是2mM;b、菌株鑒定 提取A4B菌株的總DNA，然后PCR擴增16SrDNA，將PCR產物提純后進行堿基測序； 通過對序列進行數據庫檢索和系統進化樹構建后，判明A4B菌株屬于Microbulbifer微泡 菌，所述的微泡菌廣泛存在于世界各地的海洋環境中；c、利用A4B菌株生物合成對羥基苯甲酸步驟： (1)準備10ml的含有1 %葡萄糖的海水培養基，海水培養基的成分； 0NR7a是人工海水培養基，成分如下表。 表0NR7的組成【主權項】1. 一種，其特征是： a、 篩選分離天然合成對羥基苯甲酸和酯類的A4B菌株 制備含有指示菌柱的平板，在液體的人工海水培養基中加入2%的瓊脂，高壓加熱滅菌 后，溫度降到大約50°C，瓊脂凝固之前參入細胞濃度為IOVl的B. subtilis lml，混勻后制 備成平皿；然后在平皿的中央位置放上一個濾紙片，在濾紙片上滴入待篩選菌株的培養液； 將平皿放在37度培養箱培養；利用上述方法篩選到一個形成抑菌圈的細菌，即A4B菌株； 在人工海水培養基中加入2 %的葡萄糖作為碳源培養A4B菌株，然后利用液相色譜分 析了次級代謝產物；A4B菌株合成積累對羥基苯甲酸；A4B菌株還合成了對羥基苯甲酸甲 酯（MethyI 4HBA)，對羥基苯甲酸乙酯（Ethyl 4HBA)，對羥基苯甲酸丙酯（PropyI 4HBA)， 對羥基苯甲酸丁酯（Butyl 4HBA)，對羥基苯酸庚酯Ofeptyl 4HBA)和對羥基苯酸壬酯 (Nonoyl 4HBA)，各個的合成量大約是2mM ; b、 菌株鑒定 提取A4B菌株的總DNA，然后PCR擴增16S rDNA，將PCR產物提純后進行堿基測序；通 過對序列進行數據庫檢索和系統進化樹構建后，判明A4B菌株屬于Microbulbifer微泡菌， 所述的微泡菌廣泛存在于世界各地的海洋環境中； c、 利用A4B菌株生物合成對羥基苯甲酸步驟： (1)準備IOml的含有1 %葡萄糖的海水培養基，海水培養基的成分； 0NR7a是人工海水培養基，成分如下表。 表0NR7的組成(2) 接種A4B菌株培養24小時，培養溫度為35°C這本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種微泡菌屬細菌生物合成對羥基苯甲酸和酯類的方法，其特征是：a、篩選分離天然合成對羥基苯甲酸和酯類的A4B菌株制備含有指示菌柱的平板，在液體的人工海水培養基中加入2％的瓊脂，高壓加熱滅菌后，溫度降到大約50℃，瓊脂凝固之前參入細胞濃度為108/L的B.subtilis?1ml，混勻后制備成平皿；然后在平皿的中央位置放上一個濾紙片，在濾紙片上滴入待篩選菌株的培養液；將平皿放在37度培養箱培養；利用上述方法篩選到一個形成抑菌圈的細菌，即A4B菌株；在人工海水培養基中加入2％的葡萄糖作為碳源培養A4B菌株，然后利用液相色譜分析了次級代謝產物；A4B菌株合成積累對羥基苯甲酸；A4B菌株還合成了對羥基苯甲酸甲酯(Methyl?4HBA)，對羥基苯甲酸乙酯(Ethyl?4HBA)，對羥基苯甲酸丙酯(Propyl?4HBA)，對羥基苯甲酸丁酯(Butyl?4HBA)，對羥基苯酸庚酯(Heptyl?4HBA)和對羥基苯酸壬酯(Nonoyl?4HBA)，各個的合成量大約是2mM；b、菌株鑒定提取A4B菌株的總DNA，然后PCR擴增16S?rDNA，將PCR產物提純后進行堿基測序；通過對序列進行數據庫檢索和系統進化樹構建后，判明A4B菌株屬于Microbulbifer微泡菌，所述的微泡菌廣泛存在于世界各地的海洋環境中；c、利用A4B菌株生物合成對羥基苯甲酸步驟：(1)準備10ml的含有1％葡萄糖的海水培養基，海水培養基的成分；ONR7a是人工海水培養基，成分如下表。表??ONR7的組成(2)接種A4B菌株培養24小時，培養溫度為35℃這個培養過程是預培養，得到的培養液是預培養液；(3)準備10L的發酵罐，裝入8L的含有1％葡萄糖的海水培養基；(4)接種10ml預培養的菌液，在35℃培養到穩定后期，利用液相色譜檢測葡萄糖消耗完后停止培養；(5)離心將菌體除去，收集上清液體，加入鹽酸將液體的pH調成酸性；(6)加入和上清等量的乙酸乙酯萃取對羥基苯甲酸；(7)收集含有對羥基苯甲酸的乙酸乙酯相，利用蒸發儀蒸發乙酸乙酯，獲得對羥基苯甲酸。d、利用A4B菌株生物合成對羥基苯甲酸酯類的步驟：(1)準備10ml的含有1％葡萄糖的海水培養基；(2)接種A4B菌株培養24小時，培養溫度為35℃這個培養過程是預培養，得到的培養液是預培養液；(3)準備10L的發酵罐，裝入8L的含有1％葡萄糖的海水培養基；(4)接種10ml預培養的菌液，在35℃培養到穩定后期，利用液相色譜檢測葡萄糖消耗完后停止培養；(5)離心將菌體除去，收集上清液體；(6)加入和上清等量的乙酸乙酯萃取對羥基苯甲酸；(7)收集含有對羥基苯甲酸的乙酸乙酯相，利用蒸發儀蒸發乙酸乙酯，獲得對羥基苯甲酸酯類。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：彭學，馮昭中，田俊，朱莉，許超艷，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32