一種消化酶組合物及其制劑、應用制造技術

本發(fā)明專利技術涉及干細胞分離技術領域，特別涉及一種消化酶組合物及其制劑、應用。該消化酶組合物包括膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶。本發(fā)明專利技術提供的消化酶組合物能夠高效地從胎盤組織塊中分離MSC，提高了胎盤MSC的分離效率；本發(fā)明專利技術提供的消化酶組合物能夠減少對細胞的損傷，從而使細胞活率高，同時具有較強的增殖能力，提高細胞收獲量。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及干細胞分離
，特別涉及。
技術介紹
間充質干細胞（MesenchymalStemCells，MSCs)是一群非造血功能的，主要存在 與結締組織和器官間質中的一類同種多能干細胞。體外培養(yǎng)的實驗研宄發(fā)現(xiàn)，在不同的誘 導條件下，胎盤MSC可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和神經元，并表達特異性標志， 如osteopontin、PPAR-y2、collagenII、NSE等，誘導體系與骨髓MSC沒有太大的差別，表 明胎盤MSC同樣具有廣泛的分化潛能。近年來，已有具有干/祖細胞特征的間充質細胞自骨 髓、外周血、密質骨、軟骨、肌肉等組織中分離出來，這些組織的一個共同特征就是來源于胚 胎發(fā)育期的中胚層，胎盤由滋養(yǎng)細胞及大量起源于胚外中胚層的間充質和血管共同組成， 提示胎盤中存在間充質干細胞（MSC)成分。科學家們經過證實確定胎盤中含有大量豐富的 MSCs。而且，胎盤MSC與骨髓MSC在細胞形態(tài)，細胞表面標志表達和基因表達模式上非常相 似。由于胎盤MSCs的數(shù)量很大，在今后的試驗和臨床應用上，胎盤已經成為一種無倫理學 爭議和簡便獲得的MSCs的新來源。MSCs的分離一般采用胰蛋白酶消化，具體方法為：取新鮮健康臍帶，用PBS沖洗干 凈后，用剪刀鑷子剔去血管，剝出里面的華氏膠組織，將所得組織充分剪碎至1mm3大小，加 入a-MEM培養(yǎng)液置于37°C，5%的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10%FBS，100U/mL青霉素， 100U/mL鏈霉素。臍帶組織培養(yǎng)5-7天后，可見有部分細胞從組織塊周圍爬出，形態(tài)呈細小 的梭形，一周后，細胞開始迅速增殖，形成大小不等的細胞集落，待細胞長滿后，用〇. 25%胰 蛋白酶消化傳代。 從胎盤組織中分離MSC還有采取膠原酶消化組織塊的辦法。李鐸于2011年報道 了應用膠原酶消化法對人臍帶間充質干細胞進行分離培養(yǎng)。CN104284976A中采用胰蛋白酶和DNaseI對胎盤干細胞進行了分離培養(yǎng)，具體 為：在含有25mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES)的平衡鹽溶液（HBSS)中，將35至40g胎盤 絨毛組織用0. 15%胰蛋白酶和0. 02%DNaseI在37°C下水浴消化30min，重復3次。在最 后兩次消化中，靜置組織碎片，用200uM孔徑尼龍篩網過濾上清液，至多45mL細胞懸液分層 在5mLFCS血清上，室溫1000Xg離心10min。 又如文獻（姚旺祥等.兔胎盤源性間充質干祖細胞的分離方法比較.生物醫(yī)學工 程與臨床.2007年02期）采用II型膠原酶+DNaseI對胎盤組織進行消化。 但上述方法存在細胞收獲率低或者細胞活力低的問題。因此，提供一種細胞收獲 率高、細胞活力高的胎盤間充質干細胞的分離培養(yǎng)方法具有重要的現(xiàn)實意義。
技術實現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術提供了。本專利技術提供的消化酶 組合物能夠高效地從胎盤組織塊中分離MSC，提高了胎盤MSC的分離效率；本專利技術提供的消 化酶組合物能夠減少對細胞的損傷，從而使細胞活率高，同時具有較強的增殖能力，提高細 胞收獲量。 為了實現(xiàn)上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案： 本專利技術提供了一種消化酶組合物，包括膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶。 本專利技術使用膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶聯(lián)合消化胎盤組織，使得消化 酶組合物產生了協(xié)同增效作用，提高了細胞的收獲量及活率，減少了對細胞的損傷，提高了 增殖速率。 作為優(yōu)選，膠原酶I、中性蛋白酶與脫氧核糖核酸酶體積比為（0. 1~10) : (0. 1~ 10):(0? 1 ~10)〇 優(yōu)選地，膠原酶I、中性蛋白酶與脫氧核糖核酸酶體積比為1 :〇. 5 :2。 本專利技術還提供了一種消化酶混合液，包括本專利技術提供的消化酶組合物和PBS ;該 消化酶組合物包括膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶；作為優(yōu)選，膠原酶I、中性蛋白 酶與脫氧核糖核酸酶的體積比為（〇? 1~10) : (〇? 1~10) : (〇? 1~10);優(yōu)選地，膠原酶I、 中性蛋白酶與脫氧核糖核酸酶體積比為1 :〇. 5 :2。 作為優(yōu)選，在消化酶混合液中，膠原酶I的濃度為0. 1~10yg/mL，中性蛋白酶的 濃度為〇. 1~10yg/mL，脫氧核糖核酸酶的濃度為0. 1~10yg/mL。 在本專利技術提供的一些實施例中，膠原酶I的規(guī)格為125⑶U/mg。 在本專利技術提供的一些實施例中，中性蛋白酶的規(guī)格為50000U/g。 在本專利技術提供的一些實施例中，脫氧核糖核酸酶的規(guī)格2000Kunitzunits/mg。 在本專利技術提供的一些實施例中，在消化酶混合液中，膠原酶I的濃度為1yg/mL， 中性蛋白酶的濃度為〇. 5yg/mL，脫氧核糖核酸酶的濃度為2yg/mL。 在本專利技術提供的另一些實施例中，在消化酶混合液中，膠原酶I的濃度為0. 1yg/ mL，中性蛋白酶的濃度為1yg/mL，脫氧核糖核酸酶的濃度為10yg/mL。在本專利技術提供的另一些實施例中，在消化酶混合液中，膠原酶I的濃度為5yg/mL，中性蛋白酶的濃度為10yg/mL，脫氧核糖核酸酶的濃度為0. 1yg/mL。 在本專利技術提供的另一些實施例中，在消化酶混合液中，膠原酶I的濃度為10yg/ mL，中性蛋白酶的濃度為0. 1yg/mL，脫氧核糖核酸酶的濃度為1yg/mL。 本專利技術還提供了本專利技術消化酶組合物或消化酶混合液在分離間充質干細胞中的 應用；該消化酶組合物包括膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶；作為優(yōu)選，膠原酶I、 中性蛋白酶與脫氧核糖核酸酶的體積比為（〇. 1~10) :(〇. 1~10) :(〇. 1~10);優(yōu)選地， 膠原酶I、中性蛋白酶與脫氧核糖核酸酶的體積比為1 :〇. 5 :2; 本專利技術消化酶混合液包括本專利技術消化酶組合物和PBS;作為優(yōu)選，在消化酶混合 液中，膠原酶I的濃度為0. 1~10yg/mL，中性蛋白酶的濃度為0. 1~10yg/mL，脫氧核糖 核酸酶的濃度為〇. 1~10ug/mL。 在本專利技術提供的一些實施例中，間充質干細胞為胎盤間充質干細胞。 本專利技術還提供了一種分離胎盤間充質干細胞的方法，采用本專利技術消化酶組合物， 或者采用本專利技術消化酶混合液消化胎盤組織。 作為優(yōu)選，消化的溫度為36~38°C。 優(yōu)選地，消化的溫度為37°C。 作為優(yōu)選，消化的時間為10~60min。 優(yōu)選地，消化的時間為30min。 本專利技術提供了。該消化酶組合物包括膠原酶I、 中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶。本專利技術至少具有如下優(yōu)勢之一： 本專利技術提供的消化酶組合物能夠高效地從胎盤組織塊中分離MSC，提高了胎盤 MSC的分離效率； 本專利技術提供的消化酶組合物能夠減少對細胞的損傷，從而使細胞活率高，同時具 有較強的增殖能力，提高細胞收獲量。【附圖說明】 圖1示分離獲得的MSCs的形態(tài)（P1代）；A(40倍）和B(100倍）示用消化酶混合 液1獲得的人MSCs，并用Gimsa染色觀察其細胞形態(tài)；C(40倍）和D(100倍）用消化酶混 合液2獲得的人MSCs并用Gimsa染色觀察其細胞形態(tài)； 圖2示流式細胞術檢測胎盤貼壁細胞表型，表面抗原包括⑶14、⑶29、⑶34、⑶44、 ⑶45、⑶73、⑶90、⑶105 ;其中2-1示消化酶混合液1消化獲得細胞表型；2-2示消化酶混 合液2消化本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種消化酶組合物，其特征在于，包括膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：葛嘯虎，陳海佳，王一飛，盧瑞珊，王小燕，李平，馬巖巖，
申請(專利權)人：廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44