本發明專利技術涉及一種草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79及其制備方法，蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。制備方法包括：(1)采用重組載體轉化宿主細胞，得到重組菌株；(2)培養重組菌株，誘導重組草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79的表達；(3)超聲破碎獲取所表達的草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79。根據本發明專利技術的對機體具有免疫調節作用的真菌免疫調節蛋白及其基因序列，可以制備出提高人體免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所導致的疾病的危害。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于真菌免疫調節蛋白領域，特別涉及一種草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79及其制備方法。
技術介紹
利用大型真菌(蘑菇)及其活性物質治療人類疾病在亞洲國家有著悠久的歷史，可以追溯到公元前3000年，由于其在免疫調節和抗癌方面的出色表現，近十年來在西方國家也逐漸受到重視。過去對于大型真菌活性物質的研究多集中在多糖和三萜，對于蛋白質的研究相對較少，但隨著生物技術在藥物研究和開發中的應用，特別是對中草藥中基因、蛋白和藥理作用之間關系研究的逐漸深入，真菌蛋白逐步得到了重視，其中真菌免疫調節蛋白(Fungal?immunomodulatory?protein，FIP)，由于其具有廣泛的免疫生物活性，而備受國內外關注。真菌免疫調節蛋白(Fungal?immunomodulatory?protein，FIP)是從高等擔子菌中分離得到的一類具有免疫調節活性的小分子蛋白質，其結構與功能與植物凝集素和免疫球蛋白重鏈可變區相似，具有促進淋巴細胞增殖、調控細胞周期、誘發細胞凋亡、影響細胞因子的表達、活化細胞粘附分子和抗過敏反應等免疫調節作用，擁有良好的臨床應用前景和藥用保健價值。自1989年，日本人Kino從靈芝(Ganoderma?lucidum)子實體中分離到第一個真菌免疫調節蛋白，命名為Ling?Zhi-8(LZ-8)，并對其基因序列，氨基酸順序和免疫生理活性進行了測定。到目前為止，共有8種FIPs被分離純化出來，它們來自于靈芝(Ganoderma?lucidium)，松杉靈芝(G.tsugae)，紫芝(G.japoncium)，小孢子靈芝(G.microsporum)，甜靈芝(G.sinense)拱狀靈芝(G.fornicatum)，金針菇(Flammulina?velutipes)和草菇(Volvariella?volvacea)，分別被命名為LZ-8(FIP-glu),FIP-gts,FIP-gja(AY987795),FIP-gmi,FIP-sin,FIP-gfo，FIP-fve和FIP-vvo,共同組成了一個新的蛋白質家族–FIPs。在FIPs家族中除了金針菇免疫調節蛋白(FIP-fve)和草菇免疫調節蛋白(FIP-vvo)以外，其他的FIPs都是從不同種靈芝中分離得到的，這說明雖然都是靈芝但由于種類的不同，而具有不同的免疫調節蛋白，甚至同種靈芝中就存在多種免疫調節蛋白。例如葉波平等從靈芝(G.microsporum)中分離到3個蛋白質：LZP-1、LZP-2和LZP-3。體外實驗表明3種靈芝蛋白具有較強的促進淋巴細胞增殖活性，而且SDS-PAGE表明其分子量與LZ-8不同，所以他們獲得了3種新的靈芝免疫調節蛋白。這樣的情況同樣發生在草菇中。除了1997年Hsu,H.C.等人在草菇子子實體中通過分離純化和驗證，并經過直接氨基酸測序得到由112個氨基酸組成的分子量約為12.67KDa的一種草菇免疫調節蛋白(FIP-vvo)以外，還有可能存在其它種草菇免疫調節蛋白。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79及其制備方法，通過比較基因組等生物信息學方法篩選到一種同樣來源于草菇，但基因序列和氨基酸序列都不同于FIP-vvo的具有免疫調節作用的免疫調節蛋白FIP-vvo79，其適用于在保健品和醫藥中使用。本專利技術提供了一種草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。該草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79全長113個氨基酸，理論分子量為12.82kDa。本專利技術還提供并合成了編碼上述草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79的基因。該基因cDNA序列如SEQ?ID?NO.2所示。本專利技術通過一對引物FIP-vvo79-F(NdeI?5’-CAT?ATG?TCT?ACC?GAT?TTG?A-3’)和FIP-vvo79-R(EcoRI?5’-CTT?AAG?TTA?TTC?CAC?TGA?GCA-3’)。用基因克隆的方法得到了這一草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79的基因序列，DNA全序列分析結果表明，FIP-vvo79基因全長338bp。該蛋白屬于一種草菇免疫調節蛋白。將其cDNA序列在GenBank中進行BLAST比對，沒有發現與其相似的基因序列，而將其氨基酸序列在NCBI的無冗余蛋白序列數據庫(nr)中進行BLAST比對發現，該蛋白與來源于平蓋靈芝(G.applanatum)、赤芝(G.lucidum)和小孢子靈芝(G.microsporum)免疫調節蛋白的相似性達到63％，與金針菇(F.velutipes)免疫調節蛋白FIP-fve為57％。說明FIP-vvo79是一種新的真菌免疫調節蛋白，其編碼的基因是一個新的基因。并為此編碼此蛋白的基因改造和在各種外源基因表達系統中高效表達提供優良的基因資源。本專利技術還提供了包含上述草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79基因的重組載體，優先選為pET-28b(+)。將本專利技術的草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本專利技術的一個最優選的方案，優選為將草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79基因插入到pET-28b(+)上的EcoRI和NdeI限制性酶切位點之間，得到重組大腸表達質粒pET-FIP-vvo79。本專利技術還提供了包含了上述草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79基因的重組菌株，優選為重組菌株BL21-FIP-vvo79。本專利技術還提供了一種制備草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79的方法，包括以下步驟：1.上述重組載體轉化宿主細胞，得到重組菌株；2.培養重組菌株，誘導重組草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79的表達；3.超聲破碎獲取所表達的草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79。其中，優選所述宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)細胞，優選將重組表達質粒轉化大腸桿菌細胞BL21(DE3)，得到重組菌株BL21-FIP-vvo79。運用基因工程手段來產業化生產草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79產品還未見報道。本專利技術首次提供了一個真菌免疫調節蛋白FIP-vvo79，可作應用于保健品和醫藥等工業。根據本專利技術的技術方案就可以實現利用基因工程手段生產草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79。本專利技術利用生物信息學的方法，在草菇基因組中發現了一種與已知草菇免疫調節蛋白(FIP-vvo)差異性達到5％即相似性為95％的新的草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79及其編碼基因序列。并利用分子生物學和生物工程技術，構建高效表達這種草菇免疫調節蛋白本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種草菇免疫調節蛋白FIP?vvo79，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1
所示。
2.一種編碼如權利要求1所述的草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79的基因，其特征在于：所述基
因的cDNA序列如SEQ?ID?NO.2所示。
3.一種含如權利要求1所述的草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79的重組載體。
4.根據權利要求3所述的一種草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79的重組載體，其特征在于：所述
重組載體為pET-28b(+)。
5.根據權利要求4所述的一種草菇免疫調節蛋白FIP-vvo79的重組載體，其特征在于：將草
菇免疫調節蛋白FIP-vvo79基因插入到pET-28b(+)上的EcoRI和NdeI限制性酶切位點
之間，得到重組...
【專利技術屬性】
技術研發人員：汪瀅，鮑大鵬，王瑩，王榮，唐利華，茅文俊，周陳力，龔明，李燕，萬佳寧，
申請(專利權)人：上海市農業科學院，
類型：發明
國別省市：上海;31
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