(R)-羰基還原酶在近平滑假絲酵母中原位表達重組菌及用其高效制備(R)-苯基乙二醇的方法，屬于生物催化不對稱轉化技術領域。本發明專利技術提供了一株近平滑假絲酵母重組菌Candida?parapsilosis?pCP-rcr，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC?NO：M2015106；本發明專利技術構建了外源蛋白在近平滑假絲酵母中的表達質粒pCP，將(R)-羰基還原酶克隆到該質粒中，獲得重組質粒pCP-rcr，電擊轉化入近平滑假絲酵母獲得重組菌株Candida?parapsilosis?pCP-rcr。該重組菌催化2-羥基苯乙酮，通過優化生物轉化反應條件，產物(R)-苯基乙二醇光學純度達到99.9%，產率為99.6%，生物轉化的時間由48?h縮短到13?h，為高效、低成本制備(R)-苯基乙二醇提供了有效途徑。
【技術實現步驟摘要】
利用設計的近平滑假絲酵母的表達質粒，實現（功-羰基還原酶的表達，高效制備 (功-苯基乙二醇的方法，本專利技術涉及基因工程手段構建（功-羰基還原酶在近平滑假絲酵 母中的原位表達重組菌，及用其高效制備（功-苯基乙二醇的方法，屬于生物催化不對稱轉 化
技術介紹
手性醇是合成許多高價值手性化合物的前體物質，在制藥工業、精細化工產業和 信息工業中均應用廣泛。光學純（功-苯基乙二醇不僅是液晶材料中不可缺少的重要手性 添加劑，而且已成為制備具有光學活性的醫藥、農藥和功能材料的重要中間體，開展制備高 光學純度的（功-苯基乙二醇的研宄極有意義。【主權項】1. 一株不對稱轉化制備（功-苯基乙二醇的原位表達重組菌，其分類命名為近平滑假 絲酵母菌/(功-羰基還原酶pCP-rcr，已保藏于中國典型培養物保 藏中心，保藏編號：CCTCC NO :M2015106。2. 利用權利要求1所述的原位表達重組菌不對稱轉化制備（功-苯基乙二醇的方法， 其特征是將U)-羰基還原酶在近平滑假絲酵母中原位表達后，利用培養后的重組菌株 pCP-rcr，以2-羥基苯乙酮為底物，催化不對稱轉化反應：在2 mL 0.1 mol/L pH 6. 5的磷酸緩沖液中，加入重組細胞濃度0.1 g/mL，2-羥基苯乙酮底物濃度 為6 g/L，反應溫度30°C，反應時間13 h。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征是重組菌株pCP-rcr的 培養 生長培養基YPD以g/L計：胰蛋白胨20,酵母提取物10,葡萄糖20,以去離子水配制； 固體培養基添加15g/L瓊脂粉； 發酵培養基以g/L計：酵母提取物5,葡萄糖40,（NH4)2HPO4 13, KH2PO4 7, ZnSO4 · 7H20 0· 3, NaCl 0· 1，ρΗ7· 0,以去離子水配制； 培養條件：挑取重組菌株pCP-rcr的單菌落接種于5 mL YPD 液體培養基中，于30°C、200 r/min振蕩培養12 h;取I mL培養液轉接于50 mL發酵培養 基中，于30°C、200 r/min振蕩培養培養48 h。4. 根據權利要求2所述的方法，其特征是重組菌株pCP-rcr的 構建： 將目的基因 rcr插入近平滑假絲酵母原位表達質粒pCP中，構建重組質粒pCP- rcr，重 組質粒pCP-rc/^化近平滑假絲酵母感受態細胞，通過含有40 μ g/mL諾爾斯菌素的YPD 平板篩選目的重組菌株C pCP-rcr。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征是重組質粒pCP- rcr的構建： 目的基因 rcr及表達質粒pCP分別用I酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分析并 過柱純化，純化后的酶切產物rcr及表達質粒pCP采用連接酶進行連接，于16°C培養箱中連 接12-16 h ;連接產物轉化凡cWi JM109感受態細胞，涂布到含有100 μ g/mL氨芐青霉 素的LB平板上，LB平板：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L和瓊脂20 g/L ;37°C 倒置培養過夜； 挑取4個克隆，轉接入裝有5 mL的含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中， LB液體培養基：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L和NaCl 10 g/L ;37°C培養12 h，利用北京博 大泰克生物基因技術有限公司的質粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit提 取質粒；重組質粒采用酶切方法進行驗證：10XQuickCut Buffer 2 yL，質粒DNA 5 yL, fee I 0· 5 μ L，J/7/7 I 0· 5 μ L，ddH20 將體系補足 20 μ L，獲得陽性質粒 pCP-rcr。6. 根據權利要求4所述的方法，其特征是rcr基因的獲得 以近平滑假絲酵母基因組rcr為PCR反應模板，利用含有5^席卩幻7/7/β艮制性酶切位 點的引物RCR_1和RCR_2 : RCR_1 :5' -ctacaactat tccgcgggag ctcatgtcaa ttccatca-3'，劃線為 I， RCR_2 :5' -cactcggtac cctagtggtg gtggtggtgg tgtggattaa aa_3'，劃線為命/? I， PCR 反應體系：CldH2O 33.5 yL，DNA 聚合酶 0.5 yL，RCR_l I yL，RCR_2 I yL， 5. buffer 10 μ L, dNTP 4 yL ； PCR 條件為：98°C 熱變性 10 s;98°C 10 s，52°C 15 s，72°C 70s; 經過30個循環后，最后72°C再延伸10 min，獲得rcr基因，rcr基因全長為1011 bp。7. 根據權利要求4所述的方法，其特征是原位表達質粒pCP的構建： 質粒PCP是由pUC57為起始模板構建而來，包含以下幾個元件：啟動子基因姻Z辦 和JCT7/7,終止子基因和邵同時作為下游同源臂，以及表達盒上游同源臂基因 W3p和抗性基因說71 ; 質粒PCP構建引物設計： URA3p_l: 5' -ccggaattcg tattgcaaac aaacg-3'，劃線為 I， URA3p_2: 5' -cgcatccatt cagatcttgt atgaagacgg ca_3'，劃線為兔1·/ II， MAL2p_l: 5' -gtcttcatac aagatctgaa tggatgcggg-3'，劃線為兔1·/ II， MAL2p_2: 5' -attgacatga gctcccgcgg aatagttgta gta-3?, Sac I, ACTlt_l: 5' -caccactagg gtaccgagtg aaattct-3'，劃線為命/? I， ACTlt_2: 5' -gtcttcctgc agattttatg atggaat-3'，劃線為 I， ACTlp_l: 5? -aaaatctgca ggaagaccgt ccaac-3'，劃線為I， ACTlp_2: 5' -tttaagctta tctgcggccg caccgttatc gataactaaa_3'，劃線為 Abi I， SAT1_1: 5' -cgataacggt gcggccgcat gaaaatttcg gtga-3'，劃線為 Abi I， SAT1_2: 5' -gattaaatat tcggatcctt aggcgtcatc ct_3'，劃線為 ifeMl I， URA3t_l: 5' -gatgacgcct aaggatccga atatttaatc at-3'，劃線為 ifeMl I， URA3t_2: 5' -atcccaagct taacgatcaa gagaaa-3'，劃線為 III， 表達質粒pCP全長4. 5 Kb，采用重疊延伸和酶切連接的方法構建： 將序列經TA克隆，連接到載體pMD19-T上，得到T- 質粒；使用引物SAT1_1 和URA3t_2，以和araJi片段為模板，經過重疊延伸PCR擴增得到 將質粒及片段分別用限制性內切酶Abi I和//ifld III進行本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株不對稱轉化制備(R)?苯基乙二醇的原位表達重組菌，其分類命名為近平滑假絲酵母菌/(R)?羰基還原酶Candida?parapsilosis?pCP?rcr，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO：M2015106。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張榮珍，徐巖，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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