一種甘蔗梢腐病的病原菌的分離鑒定方法技術

本發明專利技術公開了一種甘蔗梢腐病的病原菌的分離鑒定方法，屬于植物病原菌分離技術領域。其包括如下步驟：(1)病原菌的分離；(2)病原菌的培養；(3)病原菌的電子顯微鏡檢測；(4)病原菌的等溫PCR鑒定。本發明專利技術既實現了甘蔗梢腐病的病原菌的體外分離、培養，又實現了甘蔗梢腐病的病原菌的快速鑒定，且可以準確檢測甘蔗種子、親本資源和育種中間材料在生長早期是否含有甘蔗梢腐病原復合物，將有效推動甘蔗的科研、育種及生產，具有廣闊的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的分離鑒定方法，屬于植物病原菌分離

技術介紹
甘鹿(Saccharum.spp)是世界上主要的糖料作物，也是優良的能源作物之一。我國是世界甘蔗發源地之一，也是世界第三大甘蔗糖生產國。除了制糖，甘蔗還用于造紙及燃料乙醇生產。甘蔗糖業對農民增收、產業結構調整和國家能源安全的保障具有重要意義。甘鹿梢腐病(Pokkah Boeng Disease，PBD)是甘鹿生長中一種發生較普遍的、世界性的甘蔗病害，1921年在印度尼西亞爪哇首次報道。目前，幾乎所有甘蔗生產國和地區都有該病發生。我國甘蔗生產區也常有梢腐病發生，福建、臺灣、廣西、云南、廣東以及海南都曾報道過，對我國甘蔗生產和糖業發展帶來巨大損失。甘蔗梢腐病(PBD)主要通過帶病植株和氣流傳播，感病后甘蔗一般表現為梢部和幼葉基部缺綠黃化，葉片扭纏或短縮，有明顯的褐色皺紋。發病最嚴重時形成梢腐，生長點周圍組織變軟、變褐，心葉壞死，使整株甘蔗枯死。受害蔗株株高比健株平均減少30?60cm，受害蔗田每畝平均減產I?2t，甘蔗糖分降低0.56 %左右，重力純度降低3 %左右，造成甘蔗產量和品質下降以及品種種性退化。甘蔗生長最旺盛的7-9月是梢腐病的主要發生時期，高溫高濕、干旱后充分灌水、施用氮肥過多或干旱后遇到降雨，都可引發梢腐病的大規模發生。甘鹿梢腐病(PBD)的病原菌為Gibberella fujikuroi (Saw.) Wolle，是一種真菌性病害。在我國，甘蔗病害的基礎性研宄比較薄弱.尤其在甘蔗抗病育種和病害的快速診斷技術上，與先進國家有較大差距。借鑒或引進國外先進病害檢測技術和抗性鑒定技術，提高甘蔗抗病育種水平和病害診斷水平，是甘蔗梢腐病研宄的重點問題。甘蔗梢腐病(PBD)的診斷技術經歷了從內部癥狀觀察一相差顯微鏡檢查一免疫技術一PCR快速檢測4個階段。我國在這方面的研宄比較落后，診斷方法以內部癥狀觀察和相差顯微鏡檢查為主，應用免疫技術和PCR檢測PBD還處于起步階段。20世紀80年代初，免疫學技術在生物醫學、動植物病原菌的檢測、診斷與防治上得了廣泛應用。1984年以來，國外不少學者將免疫技術應用于甘蔗PBD診斷，以廣西主栽品種新臺糖22 (ROC)為研宄對象，利用DNA雜交技術(Tissue blot DNA hybridizat1n和ITS序列分析檢測甘鹿梢腐病病原細菌Gibberella fujikuroi (Saw.)Wolle，也獲得了較理想的效果。PCR技術是20世紀80年代中期建立的一項體外迅速、大量擴增目的基因的技術，已廣泛地應用于分子生物學、醫學、農學等學科，用于基因的克隆遺傳分析和疾病診斷等。由于PCR能夠特異擴增某一 DNA片段，因此，在病原微生物的檢測上，比傳統方法有優勢，如PCR技術檢測生物體時不需要培養，具有極高的靈敏度、快速等。近10多年來，PCR技術在植物病害檢測中得到了廣泛應用，也有不少學者對甘蔗梢腐病(PBD)分子檢測技術進行了研宄，如張玉娟利用甘蔗PBD病原細菌的18S-28S核糖體DNA的ITS區域設計了 I對特異引物(反向引物為 PBDl: 5’ -CTCTTGGTTCTGGCATCG-3’，反向引物為 PBD2:5’ -GTTCAGCGGGTATTCCTA-3’)進行PCR檢測，檢測了 14個PBD樣本，獲得了大小為545-546DNA特異擴增產物，ITS序列與鐮刀菌同源性高達99%。等溫擴增技術(Isothermal Amplificat1n Technology)是核酸體外擴增技術，其反應過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物來達到快速核酸擴增的目的。環介導核酸等溫擴增技術(loop-mediated isothermalamplificat1n, LAMP)，就是等溫PCR技術的一種，是2000年開發的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63°C左右)保溫30?60分鐘，即可完成核酸擴增反應。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程。LAMP是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的體外分離培養，一方面可以使得我們自行利用免疫學技術獲得抗體，使廣泛用于生產上的檢測成為可能，另一方面可以分離到純凈的甘蔗梢腐病(PBD)病原菌的DNA，促進了該病原菌以DNA為基礎的檢測方法的發展，也為今后對該病原菌開展遺傳多樣性等研宄奠定了必要的基礎。但目前，尚未有甘蔗梢腐病(PBD)病原菌的體外分離和培養方法的相關報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是彌補現有技術的不足，提供一種甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的分離、培養和鑒定方法，本專利技術能實現甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的體外分離和培養，并能實現甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的鑒定。本專利技術解決上述技術問題的技術方案如下:，包括如下步驟:(I)病原菌的分離:①將患有梢腐病的甘蔗植株A的發病葉片的表面用水清洗干凈，然后從染病部位、健康部位、病健交界處分別切取葉片組織，再分別用酒精、升汞消毒，然后用無菌水沖洗，吸干表面水分，得到組織切片；②將步驟①所得組織切片接種于PDA培養基上，于28°C培養3?4d，當培養出的菌落直徑多Icm時，挑取菌落邊緣菌絲接種于新的PDA培養上，于28°C培養3?4d，重復上述操作多3次，得到純化菌種；③將步驟②所得純化菌種回接于健康的甘蔗植株B，如果甘蔗植株B的發病癥狀與甘蔗植株A的相同，前述純化菌種即可作為分離后的病原菌，于4°C保存，待用；(2)病原菌的培養:將步驟(I)所得分離后的病原菌，接種于PDA培養基上，于28°C培養3?4d，即得培養后的病原菌；(3)病原菌的電子顯微鏡檢測:取步驟(2)所得培養后的病原菌，置于電視相差顯微鏡檢測，若呈下述癥狀，則可初步判定為甘蔗梢腐病的病原菌:呈串珠狀，淡黃色，有時菌絲組合成孢梗束，小型分生孢子單細胞，長卵形，大小為6.5?11 μ mX 2.8?3.5 μ m，串生在分生孢子梗頂部；大型分生孢子鐮刀形，具隔膜3?7個，大小為30?65 μ mX 3.5?4.2 μ m，生在氣生菌絲上或分生抱子座中；(4)病原菌的等溫PCR鑒定:將步驟(3)所得初步判定為甘蔗梢腐病的病原菌，進行等溫PCR鑒定:①引物序列為:正向引物為PBDl: 5’ -CTCTTGGTTCTGGCATCG-3’，反向引物為PBD2:5’ -GTTCAGCGGGTATTCCTA-3’，預期擴增產物長度為 545_546bp ；②模板DNA的制備:a、挑取菌絲至2.0mL離心管中；b、加入現配的50yL Buffer A，混勾后，離心，得到上清液A ;c、將上清液A于95°C放置1min后，立即置于冰塊上放置3min ；d、加入現配的50yL Buffer B，混勾后，離心，得到上清液B ;e、在上清液B中，加入等體積的氯仿-異戊醇溶液，劇烈搖勻后，離心，得到上清液C，輕輕吸取上清液C至另一新的離心管，制成模板，待用；③等溫PCR 擴增體系:含 20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種甘蔗梢腐病的病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)病原菌的分離：①將患有梢腐病的甘蔗植株A的發病葉片的表面用水清洗干凈，然后從染病部位、健康部位、病健交界處分別切取葉片組織，再分別用酒精、升汞消毒，然后用無菌水沖洗，吸干表面水分，得到組織切片；②將步驟①所得組織切片接種于PDA培養基上，于28℃培養3～4d，當培養出的菌落直徑≥1cm時，挑取菌落邊緣菌絲接種于新的PDA培養上，于28℃培養3～4d，重復上述操作≥3次，得到純化菌種；③將步驟②所得純化菌種回接于健康的甘蔗植株B，如果甘蔗植株B的發病癥狀與甘蔗植株A的相同，前述純化菌種即可作為分離后的病原菌，于4℃保存，待用；(2)病原菌的培養：將步驟(1)所得分離后的病原菌，接種于PDA培養基上，于28℃培養3～4d，即得培養后的病原菌；(3)病原菌的電子顯微鏡檢測：取步驟(2)所得培養后的病原菌，置于電視相差顯微鏡檢測，若呈下述癥狀，則可初步判定為甘蔗梢腐病的病原菌：呈串珠狀，淡黃色，有時菌絲組合成孢梗束，小型分生孢子單細胞，長卵形，大小為6.5～11μm×2.8～3.5μm，串生在分生孢子梗頂部；大型分生孢子鐮刀形，具隔膜3～7個，大小為30～65μm×3.5～4.2μm，生在氣生菌絲上或分生孢子座中；(4)病原菌的等溫PCR鑒定:將步驟(3)所得初步判定為甘蔗梢腐病的病原菌，進行PCR鑒定：①引物序列為：正向引物為PBD1:5'?CTCTTGGTTCTGGCATCG?3'，反向引物為PBD2:5'?GTTCAGCGGGTATTCCTA?3'，預期擴增產物長度為545?546bp；②模板DNA的制備：a、挑取菌絲至2.0mL離心管中；b、加入現配的50μL?Buffer?A，混勻后，離心，得到上清液A；c、將上清液A于95℃放置10min后，立即置于冰塊上放置3min；d、加入現配的50μL?Buffer?B，混勻后，離心，得到上清液B；e、在上清液B中，加入等體積的氯仿?異戊醇溶液，劇烈搖勻后，離心，得到上清液C，輕輕吸取上清液C至另一新的離心管，制成模板，待用；③等溫PCR擴增體系：含20mmol/L?Tris?HCl、10mmol/L(NH4)2SO4、50mmol/L?KCl、2mmol/L?MgSO4、0.1％Tween20、25℃的pH為8.8的1×Isothermal?Amplification?Buffer?2.5μL、ddH2O?18.8μL、10mmol/L的dNTPs?Mixture?0.5μL、10μmol/L的PBD1?1μL、10μmol/L的PBD21μL、5U/μL的Bst?2.0DNA?Polymerase?0.2μL、模板DNA?1μL；④等溫PCR擴增程序:65℃等溫45min，80℃失活20min，?20℃保持；⑤取PCR擴增后的反應液5μL，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，在550bp處出現單一擴增條帶的為甘蔗梢腐病原菌，不出現單一擴增條帶的不是甘蔗梢腐病原菌。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李鳴，梁朝旭，方位寬，吳凱朝，經艷，譚芳，何姍珊，曾媛，王冠玉，王倫旺，
申請(專利權)人：廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所，
類型：發明
國別省市：廣西;45