靶向修飾的純合生物體制造技術

本文公開了純合修飾生物體以及制備和使用這些生物體的方法。

【技術實現步驟摘要】
【專利說明】 本專利技術專利申請是國際申請號為PCT/US2010/002205,國際申請日為2010年8月 11日，進入中國國家階段的申請號為"201080045005. 6"，專利技術名稱為"靶向修飾的純合生 物體"的專利技術專利申請的分案申請。 相關申請的奪叉參考 本申請要求2009年8月11日提交的美國臨時申請第61/273, 928號的權益，通過 引用將該申請全文納入本文。 聯邦咨助研究下所作專利技術的權利聲明無。
本專利技術涉及就一個或多個內源基因的靶向修飾而言為純合的生物體。更具體地， 本專利技術涉及生物體（例如，植物或動物），其中某基因的兩條等位基因都被打斷但其中該純 合敲除生物體在打斷的基因座處不含外源序列。本專利技術還涉及生物體（例如植物或動物）， 其中某基因的兩條等位基因都由轉基因的插入而被修飾，其中所述轉基因缺乏編碼報道子 (如選擇性標記）的序列。
技術介紹
具有純合靶向基因修飾的生物體（例如，植物和動物）可用于多種農業、藥物和生 物技術應用。這些生物體通常通過在所選進行修飾的基因處引發所需序列（供體）的同源 重組體而產生。但是，為了選擇供體DNA已納入靶基因座的細胞，靶載體必須同時包括正選 擇和負選擇標記。參見例如，美國專利號5, 464, 764。選出的細胞產生雜合子，必須雜交以 獲得就基因修飾而言純合的生物體。通過該過程，選擇性標記仍整合在生物體基因組內，使 得所得經修飾純合子同時包括帶修飾的基因和外源（如標記）序列。 近來，經工程改造以特異性結合靶向位點的核酸酶，包括鋅指核酸酶和尋靶 (homing)核酸內切酶如I-Scel，已經成功用于多種不同物種的基因組修飾。參加例如， 美國專利公開 20030232410 ;20050208489 ;20050026157 ;20050064474 ;20060188987 ; 20060063231 ;2008/0182332 ;2009/0111188 和國際公開TO07/014275,通過引用將這些公 開全文納入本文用于所有目的。這些ZFN可用來在靶核苷酸序列中產生雙鏈斷裂（DSB)，該 斷裂使通過在靶向基因座同源重組（靶向整合）的供體核酸引入頻率提高超過1000倍。此 外，通過非同源末端連接（NHEJ)對位點特異性DSB的不準確修復也可導致靶向基因破壞。 盡管如此，與非核酸酶方法一樣，為了在很多生物體中方便地識別核酸酶介導的 修飾，包括選擇性標記或報道基因在內的外源DNA也革E1向所選基因座。參見例如，Shukla等 (2009)Nature459(7245) :437-441 ;美國專利公開序列號 2008/0182332 和 2009/0111188。 盡管報道子的靶向整合能鑒定多種應用的修飾，該技術不總是理想的，因為其留下插入基 因組的額外外源核酸序列。 因此，仍需要組合物與方法用于產生在所需基因的基因座修飾的純合生物體，包 括在靶向修飾的基因座不含插入外源序列的純合K0生物體和不含編碼報道子如選擇性標 記的序列的純合轉基因生物體。
技術實現思路
本文描述了在所需基因座含有修飾的純合生物體以及用于產生這些生物體的方 法和系統。帶修飾的生物體包括在靶向修飾的基因座處沒有插入外源序列的純合K0生物 體，和沒有編碼報道子（如選擇性標記）的序列的純合轉基因生物體。 一方面，本文提供包含至少一個基因座的帶修飾生物體，所述基因座的兩條等位 基因都被修飾（例如，被打斷），但所述修飾生物體在經修飾基因座處不含外源序列。在其 它實施方式中，如本文所述的生物體可在任意未破壞（敲除）基因座處包含一個或多個轉 基因（外源序列）。 另一方面，本文提供包含至少一個基因座的修飾生物體，所述基因座的兩條等位 基因都包含轉基因，其中所述轉基因不包含報道子如篩選或選擇性標記。另一方面，本文提 供包含至少一個基因座的修飾生物體，所述基因座的所有等位基因（例如，在三倍體或四 倍體生物中）都包含轉基因，其中所述轉基因不包含報道子如篩選或選擇性標記。 本文描述的任意生物體可包含超過一種雙等位基因（或多等位基因）修飾（例 如，破壞或轉基因）。此外，所述生物體可以是例如真核生物（例如，植物或動物，如哺乳動 物，例如大鼠、小鼠或魚）。 另一方面，本文提供產生缺少外源序列的純合（雙等位基因）敲除生物體的方法， 所述方法包括：用介導外源序列靶向整合到基因組選定基因座的核酸酶將外源序列（如報 道子）引入細胞，鑒定外源序列已引入靶基因座（單等位基因TI細胞）的一條等位基因的 細胞，鑒定在另一等位基因處含有NHEJ缺失的單等位基因TI細胞（TI/NHEJ克?。?，使TI/ NHEJ克隆發育至繁殖上成熟，將TI/NHEJ生物體彼此雜交（或在植物的情況中，也使該生物 體"自交"），并鑒定呈現雙等位基因NHEJ修飾的子代，從而產生在靶基因座處不含外源序 列的雙等位基因敲除生物體。另一方面，本文提供產生含有所需轉基因序列而不含編碼報 道子（例如，選擇性標記）序列的純合（雙等位基因）生物體的方法，所述方法包括：利用介 導報道子外源序列靶向整合到基因組選定基因座的的核酸酶將外源報道子序列引入細胞， 將所需單個或多個轉基因序列引入細胞，其中內核酸酶介導所述轉基因序列靶向整合入基 因座的選定基因座，鑒定外源報道序列已引入靶基因座的一條等位基因內的細胞（單等位 基因報道TI細胞），鑒定在另一等位基因處包含轉基因插入的單等位基因報道TI細胞（報 道-TI/轉基因克?。?，使報道-TI/轉基因克隆發育至繁殖上成熟，將報道-TI/轉基因生物 體彼此雜交（或在植物的情況中，也使該生物體"自交"），并鑒定呈現雙等位基因轉基因插 入的子代，從而產生在靶基因座處包含所需轉基因但不含報道序列的雙等位基因生物體。 在某些實施方式中，所述核酸酶包含一種或多種鋅指核酸酶（ZFN)。在其它實施方 式中，所述核酸酶包含尋靶核酸內切酶或大范圍核酸酶或TAL-效應子結構域核酸酶融合 體（TAL-effectordomainnucleasefusion，"TALEN"）。在本文所述的任意實施方式中， 外源序列（例如，外源報道序列）和轉基因可用核酸酶同時或依序引入。在一些方面，外源 序列包含報道基因如選擇性標記（例如，對于植物為除草劑抗性基因）或篩選標記（例如， 熒光蛋白）。本文所述的任何方法都可重復以產生一處或多處純合K0的生物體或在多個基 因座含有純合轉基因插入的生物體。顯然，本文所述的任何方法都可用于包含超過兩條等 位基因的多倍體生物（例如，通過重復所述步驟），例如四倍體或四倍體植物。 另一方面，本專利技術提供可用于產生具有純合靶向基因修飾而沒有插入報道（例如 篩選或選擇）序列的生物體的試劑盒。所述試劑盒通常包括結合至靶位點（選定用于修飾 的基因座）的一種或多種核酸酶（或編碼核酸酶的多核苷酸），可選的具有核酸酶靶位點的 細胞，用于靶向整合的外源序列，可選的包含靶位點同源序列的供體轉基因，以及對以下事 項的說明：（i)將核酸酶和外源序列引入細胞內；（ii)鑒定其中外源序列插入等位基因靶 位點的細胞；（iii)鑒定在所述基因座的另一等位基因處具有外源報道序列和修飾的單等 位基因靶向整合的細胞（報道-TI/修飾細胞）；（iv)將選定細胞生本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于產生靶向修飾的純合植物的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：(a)一對鋅指核酸酶，其中每個鋅指核酸酶結合所述植物的基因組的選定靶基因座中至少12個核苷酸的靶位點；(b)用于靶向整合入選定靶基因座內的一種或多種外源序列；以及(c)對以下事項的說明：(i)將核酸酶和外源序列引入細胞；(ii)鑒定含有一種或多種外源序列插入選定靶基因座第一等位基因內的細胞；(iii)鑒定在選定靶基因座的第二等位基因處包含修飾的(ii)所得細胞；(iv)將(iii)所得細胞生長至繁殖上成熟的植物；(v)將(iv)所得植物雜交；以及(vi)鑒定(v)的雜交的就靶向基因修飾而言純合的子代。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：Y·多恩，
申請(專利權)人：桑格摩生物科學股份有限公司，
類型：發明
國別省市：美國;US