本發明專利技術公開了一種結核分枝桿菌反向斑點雜交檢測的引物、探針及其試劑盒和使用方法。所述試劑盒由PCR引物組、固定有結核分枝桿菌特異性探針的尼龍雜交膜及其他反向斑點雜交反應試劑構成。引物組由序列為TACGGTGCCCGCAAAGTG的IS1’引物和序列為AGGCGTCGGTGACAAAGG的IS2’引物構成，探針由序列為GCCTTTGTCACCGACGCCTA的Probe-B-3’探針構成。所述試劑盒的使用方法，其特征在于，可在室溫下將結核分枝桿菌與其他常見病原菌鑒別開來，靈敏度高，特異性強，操作簡便，對溫度要求較低，為結核分枝桿菌的鑒別診斷提供了技術保障。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種用于細菌鑒別檢測的引物、探針及其試劑盒和使用方法，尤其涉 及一種用于結核分枝桿菌鑒別檢測的引物、探針及其試劑盒和使用方法，屬于結核分枝桿 菌檢測領域。
技術介紹
結核病（tuberculosis)是伴隨人類歷史最長的疾病之一，也是由單一致病菌引 起死亡數最多的疾病，早在古希臘、古埃及時期就有結核病的記載。德國細菌學家柯赫 (Koch)于1882年發現并證實了結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis)是導致結 核病的病原菌。結核分枝桿菌可導致全身各處的感染，其中最為常見的為肺結核。據世界 衛生組織（WHO)統計，全球目前約有860萬人罹患結核病，130萬人死于結核病。我國作為 全球22個結核病高危險性、高負擔國家之一，結核病的發病率以平均每年增加0. 4%的速 度增長，高居各類傳染病之首。因此，尋找一種快速準確的結核分枝桿菌檢測方法已刻不容 緩。 目前，結核分枝桿菌的實驗室檢測方法主要有細菌學檢測、血清學檢測以及以分 子生物學檢測等。細菌學檢測仍不失為診斷結核病的常用方法，其中痰涂片鏡檢是確診的 依據，但其陽性率較低；結核分枝桿菌培養仍作為結核病診斷的金標準，但其耗時較長。血 清學方法是結核病診斷的重要輔助手段，但其缺乏敏感性和特異性均高的單體蛋白作為血 清學檢測結核病的特異性抗原。聚合酶鏈反應（PCR)技術因其靈敏度和特異性較好，已成 功用于臨床標本的檢測，但PCR技術需要的熱循環設備價格昂貴，且易出現假陰性，假陽 性，交叉污染等問題，使其應用具有一定的局限性。 反向斑點雜交（reversedotblot，RDB)是斑點雜交技術的一種。該技術不同 于傳統的雜交方法，而是以膜上固定探針取代了固定待測樣本DNA(PCR擴增片段或基因組 DNA)，該技術通過一次反應即可將待檢DNA樣本中某一基因座位上大部分或全部等位基因 判斷出，改變了傳統雜交法一次只能判斷一個等位基因的模式，將基因擴增與分子雜交兩 項技術相結合，可準確、直觀的觀察結果，操作簡便，敏感性高，特異性強，在基因分型、基因 突變檢測、病原體的檢測等方面有其獨特的優勢。然而，建立結核分枝桿準確、特異的反向 斑點雜交檢測方法需先針對其特有的插入序列IS6110設計特異性引物及探針。
技術實現思路
本專利技術的主要目的是提供一套用于準確檢測結核分枝桿菌的引物及探針，可將結 核分枝桿菌與其他常見病原菌進行鑒別診斷的聚合酶鏈式-反向斑點雜交反應。 所述引物及探針均針對結核分枝桿菌特有的插入序列IS6110為靶序列，基于反 向斑點雜交技術原理設計合成。引物5'端均以生物素標記，探針5'端均加有10個T尾， 其核苷酸序列為：【主權項】1. 一種用于結核分枝桿菌檢測的反向斑點雜交檢測的引物及探針，其特征在于，所述 引物及探針均針對結核分枝桿菌特有的插入序列IS6110為靶序列，基于反向斑點雜交技 術原理設計合成，可用于結核分枝桿菌檢測時的聚合酶鏈式-反向斑點雜交反應，能準確 鑒別結核分枝桿菌。引物5'端均以生物素標記，探針5'端均加有10個T尾，其核苷酸序 列為：2. -種用于檢測結核分枝桿菌的試劑盒，其特征在于，包括結核分枝桿菌特異性檢測 的引物組溶液，固定有結核分枝桿菌特異性探針的尼龍雜交膜，室溫雜交液，洗液I，洗液 II，堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素，堿性磷酸酶緩沖液，顯色底物（NBT/BCIP)，顯色緩沖液 和聚合酶鏈式反應預混合液，其特征在于，所述試劑盒可以進行結核分枝桿菌與其他常見 病原菌的鑒別診斷。 所述的結核分枝桿菌特異性檢測的引物組溶液，其特征在于，是由權利要求1所述的 引物IS1'與引物IS2'按照I : 1的比例配制而成的，引物濃度為lOymol/L;所述的固 定有結核分枝桿菌特異性探針的尼龍雜交膜，其特征在于，固定有權利要求1所述的結核 分枝桿菌特異性探針Probe-B-3'，同時設置帶生物素標記的核苷酸序列為陽性對照，設置 去離子水為陰性對照，探針的點樣濃度70-130 μ mol/L，最優濃度為100 μ mol/L ;點樣量為 0. 5 μ L。所述的室溫雜交液，其特征在于，包括3mL的20 X SSPE、100 μ L的20 % SDS和5mL 的甲酰胺，并用水補足至20mL。3. -種如權利要求2所述的用于檢測結核分枝桿菌的試劑盒的使用方法，其特征在 于，包括聚合酶鏈式反應擴增和室溫反向斑點雜交兩個主要步驟，反向斑點雜交可在室溫 下完成。 所述的聚合酶鏈式反應擴增，其特征在于，其25 μ L的反應體系包括：聚合酶鏈式反應 預混合液12. 5 μ L，引物組混合液2 μ L，DNA模板1 μ L，去離子水9. 5 μ L，陰性對照中以去 離子水代替 DNA 模板。擴增程序為：94°C，3min ;94°0,3〇8,55°0,3〇8,72°0，111^11，共30個循 環；最后在72°C下延伸5min。 所述的室溫反向斑點雜交方法，其特征在于，使用如權利要求2所述的室溫雜交液進 行雜交，具體步驟為： (1) 將固定有結核分枝桿菌特異性探針的尼龍雜交膜置于雜交管內，加入ImL雜交液； (2) 帶有生物素標記的擴增產物于95°C變性lOmin，迅速冰浴IOmin ; (3) 向雜交液中加入5 μ L變性擴增產物，120rpm下，室溫雜交120min ; (4) 棄去雜交液，用洗液I、洗液II各洗滌2次，每次IOmin ; (5) 棄去洗液，加入1000倍稀釋的堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素，于室溫反應30min ; (6) 棄去酶液，用底物緩沖液洗滌2次，每次IOmin ; (7) 棄去底物緩沖液，加入新配制的底物，避光反應15min ; (8)將底物棄去，用去離子水終止反應，待膜干燥后判定結果，每個樣品設置3個平行 試驗，至少有2次出現明顯藍紫色斑點的判定為陽性結果，無斑點的判定為陰性結果。 所述的室溫反向斑點雜交方法，其特征在于，探針點樣濃度為25-100 μ mol/L，最優濃 度為100 ymol/L;堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素稀釋倍數為1 : 1000-1 : 5000,最優稀 釋倍數為1 : 1000 ;室溫雜交時間為30min-過夜，最優時間為120min ;酶促反應時間為 15-120min，最優時間為 30min。4.如權利要求1所述的引物及探針和如權利要求2所述的試劑盒，用于結核分枝桿菌 檢測的聚合酶鏈式反應-反向斑點雜交檢測方法包括但不限定于采用微全分析技術，其特 征在于，樣品裂解、核酸提取純化、核酸擴增和檢測均集成在微全分析系統上自動完成，該 微全分析系統由微膜片泵（閥）驅動，通過程序控制微膜片泵（閥）的開啟與閉合實現微 流體樣品的驅動控制。【專利摘要】本專利技術公開了一種結核分枝桿菌反向斑點雜交檢測的引物、探針及其試劑盒和使用方法。所述試劑盒由PCR引物組、固定有結核分枝桿菌特異性探針的尼龍雜交膜及其他反向斑點雜交反應試劑構成。引物組由序列為TACGGTGCCCGCAAAGTG的IS1’引物和序列為AGGCGTCGGTGACAAAGG的IS2’引物構成，探針由序列為GCCTTTGTCACCGACGCCTA的Probe-B-3’探針構成。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于結核分枝桿菌檢測的反向斑點雜交檢測的引物及探針，其特征在于，所述引物及探針均針對結核分枝桿菌特有的插入序列IS6110為靶序列，基于反向斑點雜交技術原理設計合成，可用于結核分枝桿菌檢測時的聚合酶鏈式?反向斑點雜交反應，能準確鑒別結核分枝桿菌。引物5’端均以生物素標記，探針5’端均加有10個T尾，其核苷酸序列為：
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄒明強，薛強，金福姝，孫福軍，郭敏卓，張帆，
申請(專利權)人：中檢國研北京科技有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11
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