用于常溫等溫快速檢測(cè)核糖核酸的蛋白酶及檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了用于常溫等溫快速檢測(cè)核糖核酸的蛋白酶，包括（1）逆轉(zhuǎn)錄酶（SEQ?ID?No.17）；（2）重組酶（SEQ?ID?No.18）；（3）單鏈結(jié)合蛋白（SEQ?ID?No.19）；（4）DNA聚合酶（SEQ?ID?No.20）；（5）輔助蛋白（SEQ?ID?No.21）。本發(fā)明專利技術(shù)還公開(kāi)了用于常溫等溫快速檢測(cè)核糖核酸的試劑以及檢測(cè)方法。本發(fā)明專利技術(shù)旨在生物體外利用公開(kāi)的多種基因工程酶與化學(xué)組分進(jìn)行核糖核酸（RNA）擴(kuò)增的模擬，通過(guò)組分間的相互作用，在常溫等溫條件下實(shí)現(xiàn)快速、一步法地完成RNA的擴(kuò)增與檢測(cè)過(guò)程，從而使病毒類病原體的檢測(cè)更快速和更簡(jiǎn)便。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)是核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的一項(xiàng)新應(yīng)用，涉及在生物體外利用多種基因工程酶和化學(xué)組分進(jìn)行模擬，通過(guò)它們之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)在常溫等溫條件下，快速、一步法地完成核糖核酸(RNA)的擴(kuò)增與檢測(cè)過(guò)程，從而使病毒類病原體的檢測(cè)更快速和更簡(jiǎn)便，因而今后能更有效地應(yīng)用于MiCT0RNA檢測(cè)或現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域當(dāng)中。
技術(shù)介紹
在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)幫助實(shí)現(xiàn)脫氧核糖核酸(DNA)的體外擴(kuò)增之后，RNA的體外擴(kuò)增也隨之引起了科學(xué)家們的關(guān)注，因此衍生技術(shù)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)也就孕育而生。最初的反轉(zhuǎn)錄PCR以兩步法，即由RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后再以cDNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)RNA的擴(kuò)增或檢測(cè)。然而隨著發(fā)展的需要，繁瑣的兩步法已不能很好地滿足檢驗(yàn)檢疫任務(wù)的需求，隨之出現(xiàn)的一步法RNA擴(kuò)增，將反應(yīng)所需組分進(jìn)行了深度優(yōu)化，在同一反應(yīng)管中實(shí)現(xiàn)了從RNA模板到產(chǎn)物DNA的擴(kuò)增檢測(cè)。盡管如此，PCR高度依賴精密的溫度循環(huán)儀進(jìn)行檢測(cè)的缺點(diǎn)，已將RNA的檢測(cè)局限于中心實(shí)驗(yàn)室中，很大程度上也限制了其在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)病毒類病原體的能力。近些年不斷壯大的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，也不乏有些技術(shù)具備現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)RNA方面的優(yōu)勢(shì)與能力，但因檢測(cè)原理的不同，都各有側(cè)重點(diǎn)與優(yōu)劣勢(shì):1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)利用4對(duì)引物特異識(shí)別6個(gè)靶位點(diǎn)和具有鏈置換活性的Bst酶，可在60-65度條件下實(shí)現(xiàn)核酸，包括DNA和RNA的快速檢測(cè)(〈60分鐘)；2)依賴于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)法，利用三種酶(AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNaseH和T7RNA聚合酶)和兩個(gè)特異性引物的介導(dǎo)，在一恒定溫度下溫育1.5-2小時(shí)，即可完成RNA模板快速增長(zhǎng)的酶促過(guò)程；3)滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)，利用DNA連接酶和DNA聚合酶，以滾環(huán)復(fù)制的模式，從一條或多條引物處進(jìn)行環(huán)形模板的鏈置換合成，從而可實(shí)現(xiàn)部分病毒的環(huán)狀基因組的擴(kuò)增，但是RCA的反應(yīng)時(shí)間偏長(zhǎng)(>4小時(shí))使其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)領(lǐng)域中的優(yōu)勢(shì)就不甚明顯；4)單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SPIA)，通過(guò)一條DNA-RNA雜合的引物、RNaseH和強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶可在55-65度下，于30分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)DNA的體外線性等溫?cái)U(kuò)增；在此基礎(chǔ)上添加的逆轉(zhuǎn)錄酶可幫助實(shí)現(xiàn)RNA模板的等溫?cái)U(kuò)增，名為Ribo-SPIA ；5)依賴解旋酶DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(HDA)，則利用解旋酶、DNA單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶和熱穩(wěn)定的逆轉(zhuǎn)錄酶共同作用，在37或65度(溫度取決于使用的DNA聚合酶)條件下，以兩步法或一步法的形式，可以實(shí)現(xiàn)RNA模板的快速擴(kuò)增(?120分鐘)；6)鏈替代擴(kuò)增(SDA)技術(shù)，是基于酶促反應(yīng)衍生而得的DNA體外等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，利用限制性內(nèi)切核酸酶和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在等溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增。因病毒引發(fā)的疾病感染性和傳染性都非常強(qiáng)，因此如有一種快速且準(zhǔn)確的方法或技術(shù)能在現(xiàn)場(chǎng)幫助完成病毒(含DNA或RNA病毒)的檢出，將能有效且及時(shí)地預(yù)防病毒疾病的擴(kuò)散與傳播。鑒于此，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)該是當(dāng)前最適合的技術(shù)種類，然而現(xiàn)有的成熟技術(shù)或者因孵育溫度，例如60-65度，仍需依賴特定溫育設(shè)備，或者因孵育時(shí)間仍相對(duì)長(zhǎng)等因素，在離真正實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)仍存在一定的差距。因此，本專利技術(shù)意在提供一種更快速、更準(zhǔn)確的適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)RNA的技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)旨在提供一種能在常溫等溫條件下，快速、一步法地完成核糖核酸(RNA)的擴(kuò)增與檢測(cè)的方法。本專利技術(shù)的第一個(gè)目的是提供用于常溫等溫快速檢測(cè)核糖核酸的蛋白酶。用于常溫等溫快速檢測(cè)核糖核酸的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶包括:(I)逆轉(zhuǎn)錄酶；(2)重組酶；(3)單鏈結(jié)合蛋白；(4) DNA聚合酶；(5)輔助蛋白；所述逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.17所示；重組酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.18所示；單鏈結(jié)合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.19所示；DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.20所示；輔助蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.21所示。本專利技術(shù)所述的常溫等溫，是指在某一恒定溫度下進(jìn)行孵育，溫度為40-42? (優(yōu)選為40°C )，接近常溫，并且是均一恒定的溫度。逆轉(zhuǎn)錄酶，是一種經(jīng)過(guò)采用點(diǎn)突變進(jìn)行基因改造后的蛋白酶，其特點(diǎn)是:1)具有DNA聚合酶活性，以RNA為模板，催化dNTP聚合生成互補(bǔ)(cDNA) ；2)通過(guò)點(diǎn)突變將原本具有的RNaseH活性失活，從而避免將DNA-RNA雜合鏈中的RNA進(jìn)行水解；3)該酶序列來(lái)源于鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)，后經(jīng)點(diǎn)突變改造；4)在反應(yīng)體系中的用量約8-12單位/ul。重組酶，是一種基因工程蛋白酶，其特點(diǎn)是:1)具有結(jié)合單鏈DNA分子的能力，因此能與引物寡核苷酸單鏈形成起始復(fù)合體；2)具有和雙鏈DNA分子結(jié)合的能力，因此才能在形成起始復(fù)合體的同時(shí)也結(jié)合DNA雙鏈或DNA-RNA雜合鏈，從而形成結(jié)構(gòu)特異的三鏈DNA中間體；3)具有同源重組活性，當(dāng)單鏈DNA侵入雙鏈DNA或雜合鏈，沿鏈尋找到同源序列區(qū)后，可將同源的單鏈排擠出去，形成所謂的局部氣泡區(qū)，進(jìn)而方便后續(xù)DNA聚合酶的介入；4)該酶序列可來(lái)源于大腸桿菌(E.coli)的RecA，或T4噬菌體重組酶uvsX，后經(jīng)進(jìn)一步基因工程改造；5)在反應(yīng)體系中的用量約100-150ng/ul。單鏈結(jié)合蛋白，是一種DNA結(jié)合蛋白，其特點(diǎn)是:1)沿形成的局部氣泡區(qū)，局部結(jié)合被替換出來(lái)的同源單鏈，避免其被核酸酶降解；2)不具備酶活性，因此不和ATP結(jié)合；3)具有協(xié)同效應(yīng)，因此可多個(gè)單鏈結(jié)合蛋白相鄰結(jié)合于DNA單鏈上，便于氣泡區(qū)的DNA合成；4)這種結(jié)合具有短時(shí)性，因此才能沿著“復(fù)制叉”不斷結(jié)合，又不斷重新組配；5)該酶序列可源于E.coli或T4的gp32蛋白；6)在反應(yīng)體系中的用量約700_1000ng/ul。DNA聚合酶，是一種依賴DNA模板進(jìn)行互補(bǔ)DNA序列合成的基因工程蛋白酶，其特點(diǎn)是:1)具有較高的連續(xù)合成能力；2)具有鏈置換活性，在合成新鏈的同時(shí)，能通過(guò)鏈置換能力配合單鏈結(jié)合蛋白將局部氣泡區(qū)沿“復(fù)制叉”方向持續(xù)推進(jìn)，從而將同源鏈替換出；3)具有3’-5’外切酶(校正能力)活性，從而保證合成的保真性；4)不耐高溫，因此非常適合在常溫等溫條件下反應(yīng)，并完成DNA鏈的合成；5)該酶的序列可源于E.coli的DNA聚合酶I Klenow大片段、Bst聚合酶、Ph1-29聚合酶、或枯草芽胞桿菌Poll (Bsu) ；6)在反應(yīng)體系中的用量約60-90ng/ul。輔助蛋白，是一種協(xié)助或增強(qiáng)重組酶活性的蛋白，其特點(diǎn)是:1)促進(jìn)并穩(wěn)定起始復(fù)合體與DNA雙鏈間的結(jié)合；2)序列可選T4噬菌體的uvsY蛋白；3)在反應(yīng)體系中的用量約 20_40ng/ul。本專利技術(shù)的第二個(gè)目的是提供用于常溫等溫快速檢測(cè)核糖核酸的試劑。用于常溫等溫快速檢測(cè)核糖核酸的試劑，其特征在于，所述試劑主要包括Tris、RNase抑制劑、dNTP、ATP、磷酸肌酸二鈉鹽、磷酸肌酶、乙酸鉀、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、二硫蘇糖醇、擴(kuò)增引物和逆轉(zhuǎn)錄酶、重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶和輔助蛋白。所述試劑中，5種蛋白(酶)與其它化學(xué)組分按一定比例配制后形成的最適反應(yīng)環(huán)境:5%PEG35000，6%海藻糖本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
用于常溫等溫快速檢測(cè)核糖核酸的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶包括：(1)逆轉(zhuǎn)錄酶；(2)重組酶；(3)單鏈結(jié)合蛋白；(4)DNA聚合酶；(5)輔助蛋白；所述逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.17所示；重組酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.18所示；單鏈結(jié)合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.19所示；DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.20所示；輔助蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.21所示。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：程奇，周國(guó)輝，李賢禎，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江泰晶生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：浙江;33