本發明專利技術提供了一種檢測重金屬鉻的免疫分析方法及免疫分析檢測試劑盒，本發明專利技術通過膠體金顆粒偶聯辣根過氧化物酶和抗鉻單克隆抗體，形成酶標記復合物，建立檢測方法；通過預處理樣品中的鉻與檢測抗原競爭結合酶標記抗體復合物，經顯色反應放大信號實現對待測樣品中鉻含量的檢測。本發明專利技術的檢測鉻的免疫分析方法為一步法競爭酶聯免疫分析方法，是一種簡便、快速且能夠高通量的檢測方法。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及免疫分析
，尤其涉及一種檢測鉻（包括三價鉻、六價鉻和總 鉻）的免疫分析方法及檢測鉻的免疫分析檢測試劑盒。
技術介紹
鉻是一種銀白色的金屬，表面具光澤，質地堅硬而脆，具有良好的延展性。自然界 沒有游離狀態的鉻，主要的礦物是鉻鐵礦。常見的化合價有三價和六價，三價鉻具有熱力 學穩定性，是人體必需的一個微量元素，具有生物學功能，例如，鉻作為葡萄糖耐受因子的 活性組分，給營養不良、糖尿病和健康人，補充適量的鉻均能有效提高人體對葡萄糖的耐受 性，能有效增強胰島素的活性；鉻缺乏能夠增加患心血管疾病的風險。但過量的鉻會對人體 健康帶來傷害，有體外實驗證明，細胞中高濃度的三價鉻能導致DNA損傷，對人體的皮膚也 具有刺激性。 而六價鉻通常以鉻酸鹽（CrO，）和重鉻酸鹽（Cr20廣）形式存在，具有變應原性、 遺傳毒性和致癌性。由于六價鉻分子量小，能很容易的經過硫酸鹽通道進入細胞內部，從 而在細胞內大量蓄積，能夠造成DNA損傷，如鏈斷裂和形成各種各樣的Cr-DNA加合物。六 價鉻導致癌癥發生的機制是：低濃度六價鉻存在下，形成嚴重的DNA損傷，并經錯配修復 (mismatchrepair，MMR)途徑，導致染色體畸形；而高劑量六價絡條件下，微衛星不穩定性 的產生導致功能性的錯配修復(mismatchrepair,MMR)完全喪失，使得基因突變頻率增加， 最終導致癌癥發生。六價鉻在生物系統內依賴抗壞血酸鹽經過一系列的還原反應最終生成 穩定的三價鉻。因此，對重金屬鉻的檢測已列為食品安全檢測中的常規檢測項目。 在食品安全檢測和環境監測中，重金屬鉻的檢測大部分采用儀器法（如原子吸收 光譜法、電感耦合等離子體質譜分析法等）和化學顯色法（二苯碳酰二肼法）。但儀器法檢 測結果精確，但是普遍存在儀器昂貴、對檢測樣品要求高、需專業技術人員操作和在大量樣 品檢測時耗費時間長等問題，難以實現現場快速檢測的需要。而化學顯色法靈敏度又不夠 高、較易受樣品中其他物質的干擾、在大量樣品檢測時，所需的耗材較多且耗時較長等。因 此，尋找一種簡便、快速和高通量的檢測方法就顯得十分重要。
技術實現思路
為解決上述問題，本專利技術實施例提供了一種檢測鉻（包括三價鉻、六價鉻和總鉻） 的免疫分析方法，通過待測樣品與鉻完全抗原競爭結合膠體金偶聯辣根過氧化物酶和抗鉻 單克隆抗體復合物并通過顯色反應放大信號實現對待測樣品中鉻含量的檢測。本專利技術實施 例提供的一種檢測鉻的免疫分析方法為一步法競爭酶聯免疫分析方法，簡便、快速且能夠 高通量檢測。本專利技術實施例還提供了一種檢測鉻（包括三價鉻、六價鉻和總鉻）的免疫分 析檢測試劑盒。 本專利技術實施例第一方面提供了一種檢測鉻（包括三價鉻、六價鉻和總鉻）的免疫 分析方法，包括以下步驟： (1)取鉻檢測用完全抗原，用碳酸鹽緩沖液進行稀釋，將稀釋后的鉻完全抗原包被 至固相載體表面，4°c包被過夜，隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體并甩干； (2)隨后加入封閉緩沖液封閉所述固相載體表面的空余間隙，37 °C封閉 0. 5-3h(優選lh)，隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體并甩干； (3)取已預處理的待測樣品，加入至步驟（2)獲得的固相載體表面，以及取濃度梯 度的鉻標準溶液按照所述待測樣品的方法設置標準曲線； (4)取膠體金顆粒偶聯辣根過氧化物酶和抗鉻單克隆抗體的復合物，與步驟（3) 中獲得的固相載體上包被的所述鉻完全抗原和所述鉻標準溶液或所述待測樣品反應連接， 37°C反應30min，隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體并甩干； (5)通過加入辣根過氧化物酶顯色劑進行顯色反應并測定光密度值或通過加入辣 根過氧化物酶發光劑進行發光反應測定光信號，根據所述鉻標準溶液所測得的吸光值繪制 標準曲線，計算待測樣品中鋅的含量； 上述步驟中，所述碳酸鹽緩沖液的濃度為0. 05M且pH值為9. 6,所述洗滌緩沖液含 有濃度為〇.015M且pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液和質量濃度為0. 05%的吐溫20,所述封閉 緩沖液中含有質量濃度為1%的小牛血清白蛋白或質量濃度為5%的脫脂奶粉且所述封閉 緩沖液的pH值為7. 4,所述稀釋緩沖液為pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液。 步驟（1)中，優選地，所述固相載體為聚苯乙烯酶標板、聚苯乙烯珠、尼龍膜、聚偏 氟乙烯膜、硝酸纖維素膜或磁性微珠。 優選地，所述鉻完全抗原的濃度為250ng/mL。 優選地，所述鉻完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑將鉻離子與載體蛋白連接 形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鋅離子通過化學鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一 端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯。 優選地，所述具有硫氰基的雙功能螯合劑為1- (4-異硫氰芐基）乙烯基二 胺-N,N,N,N-四乙酸（Isothiocyanobenzyl-EDTA簡稱iEDTA)或p-SCN-Bn-DTPA， 優選地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（OVA)。 優選地，所述鉻完全抗原的制備方法包括以下步驟： 1)制備雙功能螯合劑1-(4-異硫氰芐基）乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸（iEDTA) 溶液； 2)將含有鉻離子的溶液逐滴加入到所述1-(4-異硫氰芐基）乙烯基二 胺-N，N，N，N-四乙酸（iEDTA)溶液中，室溫下反應3~24h，制得鉻離子-雙功能螯合劑復 合物，所述鉻離子與所述1-(4-異硫氰芐基）乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸（iEDTA)的物 質的量比例為1:1 ; 3)將所述鉻離子-雙功能螯合劑復合物逐滴加入到pH值為7. 4的含有載體蛋 白的緩沖體系中制得反應混合液，調節所述反應混合液的pH值為9. 0~9. 5,室溫下反應 12~24h，反應結束后離心超濾或透析除去未反應的鉻離子和雙功能螯合劑，制得鉻完全 抗原；所述載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（OVA)，加入的所述載體蛋白（BSA) 與所述鉻離子的物質的量比例為1:20~1:50,加入的所述載體蛋白（OVA)與所述鉻離子的 物質的量比例為1:10~1:20 ;所述鉻完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑將鉻離子與 載體蛋白連接形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉻離子通過絡合作用連接，所述雙功 能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯。 步驟（3)中，優選地，所述樣品前處理過程包括以下步驟： (1)將采集的環境水樣經濾紙過濾，做好標簽，于4°C保存； (2)①檢測三價鉻：往樣品中加入乙二胺四乙酸（EDTA)溶液，螯合水樣中三價鉻 離子，用于三價鉻濃度的測定；②檢測六價鉻：往樣品中加入氫氧化鈉（NaOH)溶液，調節 其pH至9左右，沉淀除去樣品中三價鉻離子；轉移上層清液，再加入等體積的亞硫酸氫鈉 (NaHS03)或焦亞硫酸鈉（Na2S205)和EDTA的混合溶液，將六價鉻還原成三價鉻，并被EDTA螯 合形成三價鉻-EDTA復合物；③檢測總鉻：往樣品中加入等體積的亞硫酸氫鈉（NaHS03)或 焦亞硫酸鈉（Na2S205)和EDTA的混合溶液，將六價鉻還原成三價鉻，并被EDTA螯合形成三 價鉻-EDTA復合物。 上述步驟中，所述濾紙為0.22~0.45yM，所述乙二胺四乙酸溶液的終濃度為 0. 5mM~10mM，所述亞硫酸氫鈉溶液的終濃本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測重金屬鉻的免疫分析方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)取鉻檢測用完全抗原，用碳酸鹽緩沖液進行稀釋，將稀釋后的鉻完全抗原包被至固相載體表面，4℃包被過夜，隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體并甩干；(2)隨后加入封閉緩沖液封閉所述固相載體表面的空余間隙，37℃封閉0.5?3h，隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體并甩干；(3)取已預處理的待測樣品，加入至步驟(2)獲得的固相載體表面，以及取濃度梯度的鉻標準溶液按照所述待測樣品的方法設置標準曲線；(4)取膠體金顆粒偶聯辣根過氧化物酶和抗鉻單克隆抗體的復合物，與步驟(3)中獲得的固相載體上包被的所述鉻完全抗原和所述鉻標準溶液或所述待測樣品反應連接，37℃反應30min，隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體并甩干；(5)通過加入辣根過氧化物酶顯色劑進行顯色反應并測定吸光度值或通過加入辣根過氧化物酶發光劑進行發光反應測定光信號，根據所述鉻標準溶液所測得的吸光值繪制標準曲線，計算待測樣品中鉻的含量。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：鐘松清，江天久，譚攀，唐勇，鄒軍輝，謝冬霞，劉家飛，
申請(專利權)人：深圳市三方圓生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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