有生物學活性的、含C-端精氨酸的肽制造技術(shù)

本申請涉及有生物學活性的、含C-端精氨酸的肽。本發(fā)明專利技術(shù)關(guān)注來自蛋白胨的活性肽片段的分離、鑒定和表征。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【專利說明】有生物學活性的、含c-端精氨酸的肽 本申請是申請日為2008年09月05日、中國申請?zhí)枮?00880114757. 6、專利技術(shù)名稱 為"有生物學活性的、含C-端精氨酸的肽"的專利技術(shù)申請的分案申請。 專利
本專利技術(shù)關(guān)注來自蛋白胨的活性肽片段的分離、鑒定和表征。 專利技術(shù)背景 常常將動物和植物組織的水解產(chǎn)物添加至原核和真核細胞的培養(yǎng)基以提高存活 細胞數(shù)目和重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物滴度。如此，在細胞培養(yǎng)基配方中已經(jīng)廣泛采用了來自多種多 樣來源的蛋白胨來增強細胞培養(yǎng)物生長、壽命和生產(chǎn)率。然而，由于它們不明確的性質(zhì)，它 們作為用于治療性蛋白質(zhì)生產(chǎn)的培養(yǎng)基添加劑的存在呈現(xiàn)了數(shù)項挑戰(zhàn)。 動物衍生成分作為用于由哺乳動物細胞生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基添加劑的使 用會引起病毒、支原體和朊病毒污染（Kallel等，J.Biotechnol. 95:195-204(2002))。避 免在細胞培養(yǎng)基使用動物衍生成分的努力得到了歐洲和美國管理當局的支持（Castle和 Roberston, Dev. Biol. Stand. 99:191-196 (1999))。在過去的幾十年里已經(jīng)自培養(yǎng)基中成功 消除了動物血清，而且大多數(shù)當前使用的培養(yǎng)基被證實是不含蛋白質(zhì)的（Froud, Dev. Biol. Stand. 99:157-166 (1999))。然而，轉(zhuǎn)換成不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基常常導致細胞生長和生產(chǎn)力 的損失（Lee 等，J. Biotechnol. 69:85-93 (1999)) 〇 結(jié)果是，常常在細胞培養(yǎng)基中使用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（也叫作蛋白胨（P印tone))作 為營養(yǎng)添加劑，因為它們中的一些可以認為是不含蛋白質(zhì)的（Burteau等，In Vitro Cell. Dev. Biol.-Anim. 39 (7) : 291-296 (2003))。用于細胞培養(yǎng)的蛋白胨通常通過各種各樣的基 于生物學的起始材料（動物組織、奶衍生產(chǎn)品、微生物或植物）的酶促消化來制造。蛋白胨的總體效果是增強細胞生長和提高生產(chǎn)率（productivity)，且 產(chǎn)品品質(zhì)與標準培養(yǎng)基相比相同（Jan等，Cytotechnology 16:17-26(1994); Heidemann 等，Cytotechnology 32:157-167 (2000) ;Sung 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 63:527-536(2004))。數(shù)份論文顯示了蛋白胨含有諸如游離氨基酸、寡肽、鐵 鹽、脂質(zhì)和痕量元素等物質(zhì)（Franek 等，Biotechnol. Prog. 16:688-692 (2000) ;Martone 等，Bioresour. Technol. 96:383-387(2005))。一項研宄調(diào)查了蛋白胨的潛在作用，并顯 示了它們會具有營養(yǎng)效果（Heidemann 等，Cytotechnology 32:157-167(2000))。同樣， Schlaeger, J. Immunol. Meth. 194:191-199 (1996)證明了一種特定的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物展示 出抗凋亡特性。 盡管對蛋白胨在細胞培養(yǎng)中的效果進行了眾多調(diào)查，它們的作用機制仍然未知。 而且即使已經(jīng)顯示了蛋白胨在細胞培養(yǎng)過程中是有益的，然而它們的使用也具有許多缺 點。首先，由于有些蛋白胨是動物衍生的，因此產(chǎn)生以使用血清相似的問題。另外，來自其 它來源的蛋白胨也可能是外來因子（adventitious agent)的潛在來源。其次，蛋白胨中的 "活性"成分及其作用機制的不確定性使之難以測量細胞培養(yǎng)制備過程中所使用的蛋白胨 批次的品質(zhì)（如果不是不可能的話）。最后，因為蛋白胨制備的來源材料和工藝不是標準化 的或普遍可互換的，所以蛋白胨自身本性是單一來源的原材料。因此，有機會更好地表征蛋 白胨以減少或消除這些缺點。 因此，了解蛋白胨中活性成分的組成和特性以創(chuàng)建已很好確定可再生產(chǎn)濃度的、 包含詳細說明活性成分的"確定成分培養(yǎng)基"會是有利的。另外，通過打開控制細胞生長和 死亡及更好地控制重組蛋白質(zhì)表達的窗口，活性蛋白胨成分的鑒定預期導致更好地了解重 組宿主細胞和細胞系的生理學狀況。 因此，本文付出了努力來表征蛋白胨組成和了解它們對細胞培養(yǎng)的效果的機制。 本專利技術(shù)基于將動物衍生的蛋白胨（PP3)分級成可鑒定的成分，并且通過應用現(xiàn)代 分析技術(shù)（包括高分辨率質(zhì)譜術(shù)）來研宄這些化合物的性質(zhì)。本專利技術(shù)至少部分基于以精氨 酸為末端的二肽和三肽在PP3的促進生長和提高滴度的活性中發(fā)揮作用的認識。 專利技術(shù)概述 -方面，本專利技術(shù)關(guān)注式（Xl)nX2R的肽， 其中XI和X2可以相同或不同，且獨立代表精氨酸以外的任何氨基酸； n為0或 1;且 R代表精氨酸， 其中所述肽展現(xiàn)出蛋白胨生物學活性。 在一個實施方案中，所述肽是通過對蛋白胨（諸如PP3蛋白胨）分級獲得的。 在另一個實施方案中，所述肽選自表1中所列出的肽。 在另一個實施方案中，所述肽是二肽。 在又一個實施方案中，所述肽是三肽，選自表1中所列出的肽。 蛋白胨生物學活性可以例如選自下組：促進細胞生長；提高細胞密度；提高存活 細胞計數(shù)；和提高重組宿主細胞培養(yǎng)物中的生產(chǎn)產(chǎn)率。 另一方面，本專利技術(shù)關(guān)注一種組合物，其包含如上文所定義的二肽或三肽。 在一個實施方案中，所述組合物是細胞培養(yǎng)基。 又一方面，本專利技術(shù)關(guān)注一種細胞培養(yǎng)物，其包含如上文所定義的肽。 在一個實施方案中，所述細胞培養(yǎng)物是重組宿主細胞的培養(yǎng)物，其中所述重組宿 主細胞可以是任何真核或原核宿主，包括但不限于中國倉鼠卵巢（CHO)細胞和大腸桿菌細 胞。 由所述宿主細胞生成的所述異源蛋白質(zhì)可以是例如抗體（包括抗體片段）或任何 治療性蛋白質(zhì)。 還有一方面，本專利技術(shù)關(guān)注兩種或更多種如上文所定義的肽的混合物。 在一個不同的方面，本專利技術(shù)關(guān)注一種組合肽文庫，其包含（Xl)nX2R的肽、基本上由 (Xl) nX2R的肽組成、或由（Xl)nX2R的肽組成， 其中XI和X2可以相同或不同，且獨立代表精氨酸以外的任何氨基酸； n為0或 1;且 R代表精氨酸， 其中至少一些所述肽展現(xiàn)出蛋白胨生物學活性。 還有一方面，本專利技術(shù)關(guān)注一種用于重組生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，包括在適合于所 述異源蛋白質(zhì)表達的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的重組宿主細胞， 其中所述培養(yǎng)基包含至少一種權(quán)利要求1的肽。 由于下面的描述（包括實施例），本專利技術(shù)的這些和其它方面會變得顯而易見。 附圖簡述 圖1是如實施例中所描述的PP3分級和分析的示意圖。 圖2顯示了C18反相層析的結(jié)果。 圖3顯示了 C18流出（未結(jié)合）級分的層析結(jié)果。"相對比活性"定義為相等重量 的級分的活性除以PP3的。 圖4A和4B顯示了 G15純化的材料（級分F3-F7)的比活性相對于PP3的比活性 顯著升高，就其提高重組蛋白質(zhì)滴度（圖4A)和存活細胞計數(shù)（VCC ;圖4B)的能力而言。 圖5。G-15級分的質(zhì)譜分析。頂圖：級分的MS掃描。底圖：m/z 403. 2、389. 2和 375. 2 的 ms/ms 分析。 圖6。一個以R為末端的計算機（in silico)三肽文庫中肽的頻率分布。X軸：三 肽的質(zhì)量；Y軸：位于每種質(zhì)量的頻率。 圖7A和7B。PP3和本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
式(X1)nX2R的肽，其中X1和X2可以相同或不同，且獨立代表精氨酸以外的任何氨基酸；n為0或1；且R代表精氨酸，其中所述肽展現(xiàn)出蛋白胨生物學活性。

【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：詹姆斯·威爾金斯，馬薩魯·K·希拉托里，蒂姆·布里斯，
申請(專利權(quán))人：健泰科生物技術(shù)公司，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US