一種檢測水體金屬汞的微生物學方法技術

本發明專利技術提供一種檢測重金屬汞的大腸桿菌工程菌株的構建方法及其檢測水體中汞方法的建立。本發明專利技術所述基因工程菌株為merR：：PmerT：：cfp-linker-cfp/E.coliΔzntA，命名為E.coli?WMC-010(CGMCC?No.9749)，其中來源于粘質沙雷氏菌的mer操縱子敲入野生型E.coli?MC4100菌株基因組的zntA位置，啟動表達青色熒光蛋白CFP。本發明專利技術所述工程菌株能夠克服含報告質粒的報告菌株具有熒光本底值高、獨立實驗重復性欠佳和難以精確定量水體中重金屬汞的缺陷，并且能夠反映水體中汞的生物有效性，從而為客觀評價水體中汞的生物毒性效應提供依據。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種檢測汞的微生物學方法，具體涉及利用基因工程技術改造的大腸 埃希氏菌的構建方法及建立其在檢測水體環境中汞的方法，屬于環境生物

技術介紹
汞，俗稱水銀，汞是環境中毒性最強的重金屬元素之一，易揮發，在常溫、常壓下呈 液態，易流動，是唯一以氣態單質形式存在于環境中并參與全球循環的重金屬元素。汞對 人體的危害程度與汞的化學形態有關，其中有機汞化合物，尤其是甲基汞毒性最高、危害最 大。典型的汞污染事件是發生在日本熊本縣的"水俁病"事件。水俁病的起因是由于汞是 一種不能被分解或降解成無害物質的元素，一旦被排放到環境中后，便會在其中持久存在， 并以不同形態循環于空氣、水、土壤和生物圈之間。沉降后的汞會通過微生物的各種復雜的 轉化作用轉變成毒性更強的甲基汞，從而進入食物鏈。通過生物積累和生物放大作用，從食 物鏈低端到高端，生物體內汞濃度逐漸得到富集，當人們攝入汞含量水平較高的魚類或者 貝類時，各種形態的汞尤其是甲基化的汞會在人體內積累，從而危害大腦皮質，導致患者手 足協調失常，甚至步行困難、運動障礙、弱智、聽力及言語障礙、肢端麻木、感覺障礙、視野縮 小；重者例如神經錯亂、思覺失調、痙攣，最后死亡。發病起三個月內約有半數重癥者死亡， 懷孕婦女亦會將這種汞中毒帶給胎中幼兒，令幼兒天生弱智。 汞的化合物溶解度很小，除Hg(N03)2，外這種性質直接影響它在環境中的賦存形態 和迀移性及其迀移轉化規律。汞的天然來源為含汞原礦。在風化作用下，汞以固體微粒等 形態進入環境中。進入土壤中的汞可以被植物吸收，也可以揮發進入大氣，還可以被降水沖 進入地面水和地下水中。大氣中氣態和顆粒態的汞隨風飄散又可沉降到地面或水體中。由 于特殊的物理化學性質和強的毒性，汞已經成為全球關注的污染物。汞的排放來自于自然 源和人為源兩個部分，自然源包括：火山活動、自然風化、土壤排放和植被釋放等，人為源排 放指的是因人類活動引起的汞排放，包括汞的使用、物質當中含有汞雜質以及廢物處理引 起的汞排放三大類。我國是需汞大國，是僅次于西班牙和意大利的第三產汞國，人為排放是 汞污染的主要原因。它們通過排放廢水、廢渣、廢氣等方式將汞及其化合物排放到自然環境 中，造成周邊地區空氣、水體、土壤、植物等的污染，再通過多種途徑進入人體，對人體的各 個系統造成了嚴重的危害。國家規定的廢水環境中汞的排放標準<0.05mg/L，因此，檢測水 環境中汞離子的排放對環境保護是一項重要任務。 目前監測和檢測重金屬污染物主要有兩種方法：（1)物理化學分析法，如電感耦 合等離子體原子發射光譜（ICP-AES)、電感耦合等離子體質譜（ICP-MS)等，其優點是具備 高檢測靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設備昂貴，操作復雜，檢測周期長，最 重要的一點是，傳統的物理化學方法主要是對環境重金屬總量進行測定，不能檢測重金屬 的生物可利用度；（2)微生物法，微生物法一般分為基質粒整合型和基因組整合型。質粒整 合型具有成本低、檢測周期短、易操作、特異性強的優點，但是因為質粒拷貝數高以其在傳 代過程中易消失，導致檢測本底值高和檢測信號不穩定的缺點。在文獻Development of a broad-spectrum fluorescent heavy metal bacterial biosensor,Aparna Chaudhari et al，2012，Mol Biol R印，2012Dec;39(12):11225-9。中將檢測元件整合到質粒中，特異性 差，Zn 2+、Cd2+和Hg2+都能誘導此菌株產生熒光，且誘導時間在16h以上，耗時長。 微生物法原理是利用模式生物中存在的反應元件與汞化合物的分子反應機理，汞 檢測元件是此汞檢測菌株的核心。汞檢測元件必備的三個組成元件分別為：針對特定物質 (汞）的特異感應器、由感應器調控的啟動子和受啟動子控制的報告基因，這三種元件組成 的融合報告基因反應水環境中汞離子的變化情況。在眾多微生物模式生物中，細菌具有生 長快速、在環境中大量存在和成本低的優點，尤其大腸埃希氏菌是微生物傳感器研宄的普 遍研宄的模式生物。汞離子在大多數革蘭氏陰性菌種的轉運和調節機制都已經比較清楚， 但是在大腸埃希氏菌中還沒有找到相應的反應元件基因，因此，需要用基因融合技術將異 源型的特異調芐基因和啟動子與報告基因拼接在大腸埃希氏菌基因組中，并確保異源型汞 檢測元件在大腸埃希氏菌中能夠正常表達。 細菌中采的調控元件為met操縱子一般存在于Tn21和Tn501兩種轉座子中。當 環境中不存在汞離子時，調節蛋白merR充當阻遏蛋白，與啟動子結合，阻礙了 RNA聚合酶與 啟動子結合，無法啟動下游轉運基因merT和merP的表達，當環境中存在采離子時，采離子 與調節蛋白merR，調節蛋白merR與RNA聚合酶脫離，RNA聚合酶能夠與啟動子結合，啟動 下游基因表達；當環境中沒有汞離子時，RNA聚合酶與merR結合，無法與啟動子結合啟動下 游基因轉錄表達。我們嘗試將異源的調節蛋白基因、啟動子和報告基因融合在一起組成一 個汞檢測元件，再整合到大腸埃希氏菌基因組中。熒光蛋白基因是常用的報告基因，此發 明我們將用熒光蛋白作為報告基因用來替換mer操縱子中啟動子下游基因，所以當環境中 的汞離子與調芐基因結合后，啟動子啟動下游熒光蛋白基因的表達，從而通過熒光蛋白熒 光強度反應汞離子濃度。為了提高大腸埃希氏菌對汞離子的敏感性，我們嘗試將兩個相同 的焚光蛋白拼接起來，組成一個具有雙焚光蛋白的采檢測元件，文獻Versatile biosensor vectors for detection and quantify -ication of mercury, Lars Hestbjerg Hansen， et al，FEMS Microbiol Lett，2000Dec 1;193(1) :123-7。中只連接一個熒光蛋白基因 gfp， 熒光強度不高，檢測信號不強。 本專利技術所述大腸埃希氏菌生物檢測菌株可以克服質粒整合型本底高并且不穩定 的缺點，構建一種特異、敏感和快速檢測汞的大腸埃希氏菌菌株，為檢測水體中汞離子奠定 基礎。此整合后的大腸埃希氏菌應用在水環境中汞離子的濃度檢測，將造福于人類致力于 除污減排的這一大課題中。
技術實現思路
本專利技術的目的：一、采用基因工程技術構建一株熒光本底值低、穩定及定量檢測水 體中重金屬汞濃度及其生物有效性的大腸埃希氏菌生物檢測菌株；二、建立一種水體中重 金屬汞的微生物學檢測方法。
技術實現思路
之一：提供一株檢測水體中重金屬汞的大腸埃希氏菌生物檢測菌株， 本專利技術的大腸埃希氏菌（Escherichia coli)WMC_010,已于2014年9月29日在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址：北京市朝陽區北辰西 路1號院3號，中國科學院微生物研宄所，郵編100101)保藏，分類命名為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)，保藏編號為 CGMCC No. 9749。 本專利技術將兩個青色熒光蛋白連在汞檢測元件中，相對于單個熒光蛋白熒光信號更 強。 汞檢測融合報告基因含有三個組成元件：調芐基因mer本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株大腸埃希氏菌WMC?010的應用，其特征在于所述大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)WMC?010CGMCC?No.9749應用于水體重金屬汞的檢測。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：呂建新，肖芳蘭，王伍，吳文鶴，
申請(專利權)人：溫州醫科大學，
類型：發明
國別省市：浙江;33