一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法，屬于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物分析技術(shù)領(lǐng)域，主要適用于白酒固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物，包括大曲、酒醅、窖泥的酚類化合物的含量測定；具體涉及固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的超聲萃取、頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行定性、定量分析。本發(fā)明專利技術(shù)建立的方法能夠快速檢測并準確定量固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中10種揮發(fā)性酚類化合物，各酚類化合物在所測范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系R2>0.99，檢出限均小于10ug/L，相對標準偏差小于10％，回收率為75％～110％；本發(fā)明專利技術(shù)的技術(shù)方案簡便快速，能實現(xiàn)對固態(tài)發(fā)酵過程產(chǎn)物中酚類化合物的有效監(jiān)控，對于提升終產(chǎn)品的品質(zhì)具有重要意義。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法
本專利技術(shù)涉及一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法，具體涉及固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的樣品前處理及定量分析酚類化合物的方法，屬于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物分析

技術(shù)介紹
酚類化合物也稱為芳香族化合物，酚類化合物是飲料酒的香味組成部分，對于酒的聞香、口味及穩(wěn)定性等方面均具有重要的作用。揮發(fā)性酚類化合物在白酒中的含量極少，但呈香作用卻很強，在幾百萬分之一甚至千萬分之一就能使人感覺到強烈的香氣。有些揮發(fā)性酚類物質(zhì)被描述為“酚味”、“動物臭味”和“馬廄味”等異味，有些揮發(fā)性酚類物質(zhì)當其含量高于某個限值時，會使酒中產(chǎn)生腥異味，掩蓋酒的香味。因此，控制飲料酒中酚類化合物的含量對于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量和品質(zhì)非常重要。然后，對于白酒來說，白酒中的酚類物質(zhì)基本上均在固態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生，為了進一步探索這些酚類物質(zhì)的產(chǎn)生來源、形成機理、代謝途徑等，進而從釀造工藝上調(diào)控揮發(fā)性酚類物質(zhì)的含量，從而達到控制終產(chǎn)品中酚類化合物含量的目的，建立“一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法”顯得尤其必要。近年來，國內(nèi)各白酒企業(yè)或高校科研院所對白酒中的揮發(fā)性酚類物質(zhì)的測定方法進行了研究分析，但目前尚沒有關(guān)于固態(tài)發(fā)酵過程產(chǎn)物，如大曲、酒醅、窖泥發(fā)酵過程等的酚類化合物的定量分析方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所解決的技術(shù)問題是提供一種檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中10種酚類化合物的定量分析方法。本專利技術(shù)解決技術(shù)問題，采用如下技術(shù)方案：本專利技術(shù)定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法，其特點在于按如下步驟進行：首先對待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進行超聲萃取、離心取上清液置于頂空瓶中，并加入2,6-二甲基苯酚內(nèi)標溶液，通過頂空固相微萃取方式吸附富集目標物，最后通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中所含酚類化合物進行定性(以碎片的豐度比定性)、定量分析。其中所述酚類化合物包括苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-丙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2,4-二叔丁基苯酚和2,6-二叔丁基苯酚。具體按如下步驟進行：(1)超聲萃取：稱取5.0～10.0g待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物于25mL棕色具塞試管中，加入25mL體積濃度為10～15％的乙醇溶液，旋緊塞子，在避光密閉條件下充分振蕩混勻后，超聲萃取20～30min，然后采用低溫離心方式分離收集上清液，離心溫度5～10℃，離心轉(zhuǎn)速8000～10000rpm，離心10～15min；(2)頂空固相微萃取：取8～10mL所述上清液置于20mL頂空瓶中，加入10μL的2,6-二甲基苯酚內(nèi)標溶液，立即密閉頂空瓶，輕輕搖勻，然后在50～55℃恒溫預(yù)熱3～5min后，將PA萃取頭插入所述頂空瓶中，于50～55℃恒溫萃取30～40min；(3)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：在頂空固相微萃取結(jié)束后，將PA萃取頭插入到聯(lián)有質(zhì)譜檢測其的氣相色譜進樣口，230～250℃熱解析3～5min；氣相色譜條件為：色譜柱為DB-WAX毛細管柱60m×0.25mm×0.25μm；進樣口溫度230～250℃，質(zhì)譜檢測器溫度230℃，載氣He，流速0.8～1mL/min，不分流進樣；程序升溫條件為初始柱溫40℃，以4～5℃/min上升至180℃，保持2～4min,然后以5～6℃/min升溫到230℃，保持5～15min；質(zhì)譜條件為：氣相色譜與質(zhì)譜接口溫度為230℃；電離方式為電子轟擊源EI；監(jiān)測方式為選擇性離子掃描模式SIM，電離能量70eV；溶劑延遲為20～25min；(4)標準曲線的建立a、配制單標儲備液：稱取各種酚類化合物標準品，分別用無水乙醇配制成1～2mg/L的單標儲備液，采用棕色儲液瓶于4℃冰箱中避光保存；b、配制混合標準儲備液：吸取各酚類化合物的單標儲備液0.5mL混合，然后采用色譜純無水乙醇定容至50mL棕色容量瓶，獲得混合標準儲備液，于4℃冰箱中避光保存；c、配制混合標準使用液：分別吸取混合標準儲備液0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL至50mL棕色容量瓶中，加入乙醇，然后用超純水定容，配制成乙醇體積濃度為10％～15％的標準系列溶液；d、對各混合標準使用液按步驟(2)、(3)進行處理，以各酚類化合物標準品與內(nèi)標物特征離子峰的峰面積之比為橫坐標，以各酚類化合物標準品與內(nèi)標物的濃度之比為縱坐標繪制標準曲線；(5)待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的測定：將待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物按步驟(1)進行超聲萃取，按步驟(2)進行頂空固相微萃取，然后按照步驟(3)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行定性定量分析，通過標準曲線計算固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物含量。所述2,6-二甲基苯酚內(nèi)標溶液是以內(nèi)標物質(zhì)2,6-二甲基苯酚溶于色譜純無水乙醇中獲得，所述2,6-二甲基苯酚內(nèi)標溶液的溶度為70～90mg/L。10種酚類化合物和內(nèi)標物的分離質(zhì)譜圖見圖1。10種酚類化合物的定量，是以2,6-二甲基苯酚為內(nèi)標，在20μg/L～400μg/L或400μg/L～4000μg/L的檢測范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2均大于或等于0.99。具體詳見表1。表1酚類物質(zhì)標準曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)序號名稱保留時間(min)標準曲線線性方程相關(guān)系數(shù)R2內(nèi)標物2,6-二甲基苯酚28.7312,6-二叔丁基苯酚27.67y＝48.75x+11.220.9922愈創(chuàng)木酚酚27.87y＝0.1627x+0.00231.00034-甲基愈創(chuàng)木酚29.82y＝0.3031x-0.00481.0004苯酚30.68y＝0.2596x+0.05770.99954-乙基愈創(chuàng)木酚酚31.29y＝1.004x-0.00821.00064-甲基苯酚32.17y＝0.3758x-0.00460.99974-丙基愈創(chuàng)木酚32.80y＝2.789x-0.0261.00084-乙基苯酚33.90y＝0.9423x-0.00490.99994-乙烯基愈創(chuàng)木酚34.37y＝0.07639x-0.00220.999102,4-二叔丁基苯酚36.10y＝32.25x0.99010種酚類化合物的檢測限均小于10μg/L；樣品3次重復(fù)測定的相對標準偏差小于10％，回收率為75％-110％。本專利技術(shù)的主要試劑與材料：各種酚類化合物(苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-丙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2,4-二叔丁基苯酚、2,6-二叔丁基苯酚)的標準品均購于sigma公司。固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物：濃香型白酒生產(chǎn)廠家提供大曲、酒醅、窖泥用于分析測定。主要儀器包括：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent7890A-5975C；固相微萃取自動進樣器：德國Gestel三合一樣品前處理平臺；PA萃取頭：Supelco公司。回收率測定：分別在大曲、出池酒醅、窖泥樣品中添加一定量的酚類混合標準母液進行回收率測定，重現(xiàn)性實驗中每個樣品做3次平行。結(jié)果見表2。表2方法精密度和回收率本專利技術(shù)的有益效果是：本專利技術(shù)方法前處理操作簡便，不接觸任何有毒有機溶劑，且在進行固相微萃取時，頂空瓶中采取的不加鹽方式有效避免了對樣品中2,4-二叔丁基苯酚的干擾。試驗證明添加NaCl雖然可在一定程度上提高酚類化合物在質(zhì)譜圖中的響應(yīng)值，但是這一步驟的增加會導致精密度的降低，且由于NaCl中含有微量的2本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法，其特征在于按如下步驟進行：首先對待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進行超聲萃取、離心取上清液置于頂空瓶中，并加入2,6‐二甲基苯酚內(nèi)標溶液，通過頂空固相微萃取方式吸附富集目標物，最后通過氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中所含酚類化合物進行定性、定量分析。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法，其特征在于按如下步驟進行：首先對待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進行超聲萃取、離心取上清液置于頂空瓶中，并加入2,6-二甲基苯酚內(nèi)標溶液，通過頂空固相微萃取方式吸附富集目標物，最后通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中所含酚類化合物進行定性、定量分析；具體是按如下步驟進行：(1)超聲萃取：稱取5.0～10.0g待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物于25mL棕色具塞試管中，加入25mL體積濃度為10～15％的乙醇溶液，旋緊塞子，在避光密閉條件下充分振蕩混勻后，超聲萃取20～30min，然后采用低溫離心方式分離收集上清液，離心溫度5～10℃，離心轉(zhuǎn)速8000～10000rpm，離心10～15min；(2)頂空固相微萃取：取8～10mL所述上清液置于20mL頂空瓶中，加入10μL的2,6-二甲基苯酚內(nèi)標溶液，立即密閉頂空瓶，輕輕搖勻，然后在50～55℃恒溫預(yù)熱3～5min后，將PA萃取頭插入所述頂空瓶中，于50～55℃恒溫萃取30～40min；(3)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：在頂空固相微萃取結(jié)束后，將PA萃取頭插入到聯(lián)有質(zhì)譜檢測儀的氣相色譜進樣口，230～250℃熱解析3～5min；氣相色譜條件為：色譜柱為DB-WAX毛細管柱60m×0.25mm×0.25μm；進樣口溫度230～250℃，質(zhì)譜檢測器溫度230℃，載氣He，流速0.8～1mL/min，不分流進樣；程序升溫條件為初始柱溫40℃，以4～5℃/min上升至180℃，保持2～4min,然后以5～6℃/min升溫到230℃，保持5～15min；質(zhì)譜條件為：氣相色譜與質(zhì)譜接口溫度為230℃；電離方式為電子轟擊源EI；監(jiān)測方式為選擇性離子掃描...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：高江婧，劉國英，湯有宏，姜利，徐祥浩，李安軍，周慶伍，梁金輝，
申請(專利權(quán))人：安徽古井貢酒股份有限公司，安徽瑞思威爾科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：安徽;34