一種用于現(xiàn)場快速檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物與探針及其試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種用于現(xiàn)場快速檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物與探針及其試劑盒，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探針序列如SEQIDNo.3所示。其是一種特異、靈敏、簡易、快速的現(xiàn)場檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、坎納分支桿菌)的RPA-LFD引物與探針以及含有該引物與探針的試劑盒。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及應(yīng)用重組酶聚合酶擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條檢測技術(shù)(Recombinase?Polymerase?Amplification?and?Lateral?Flow?Dipstick，RPA-LFD)鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的方法和相關(guān)引物與探針以及檢測試劑盒。
技術(shù)介紹
結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium?tuberculosis?complex，MTC)中能引起人和動物的結(jié)核病的致病菌包括結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、坎納分支桿菌(M.canettii)等。結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人和動物健康的人畜共患傳染病，全球每年因結(jié)核病死亡人數(shù)約為200萬～300萬。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，我國是全球22個結(jié)核病流行嚴(yán)重的國家之一。目前我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病的14.3％，僅次于印度位居全球第2位。在結(jié)核病人中，約有1％的人通過飲用未經(jīng)消毒的牛奶等方式感染了牛分支桿菌(牛型菌)；在亞洲、非洲國家和地區(qū)，4.7％～30.8％的結(jié)核陽性牛感染的是結(jié)核分枝桿菌(人型菌)，人結(jié)核病感染越為嚴(yán)重的國家，牛感染人型菌的比例也就相應(yīng)地越高。因此，結(jié)核病的防控關(guān)系到國家的公共衛(wèi)生安全，而控制結(jié)核病傳播的關(guān)鍵就是早期準(zhǔn)確診斷。目前結(jié)核病的診斷主要依賴于對病原體的檢查，常用方法為涂片染色鏡檢、分離培養(yǎng)、免疫學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等。其中，分離培養(yǎng)法是目前診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)需要4～8周的時間，延誤臨床診斷與治療。涂片染色鏡檢法操作簡單，快速，但該法靈敏度低、特異性差。免疫學(xué)診斷則由于現(xiàn)有的抗原或抗體與其它微生物存在交叉，導(dǎo)致其特異性較差、假陽性率高。分子生物學(xué)診斷快速、靈敏，且利用特異性的DNA片段可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體內(nèi)菌種，但是以PCR技術(shù)為代表的分子生物學(xué)方法對儀器設(shè)備和技術(shù)人員要求較高，不能在結(jié)核病現(xiàn)場進(jìn)行快速診斷。雖然恒等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)可用于現(xiàn)場檢測，但是其反應(yīng)時間一般在1h，對結(jié)果的判定存在人肉眼的誤差等問題。因此，亟需建立一種可應(yīng)用于現(xiàn)場、簡易、快速檢測技術(shù)。RPA技術(shù)通過三種酶的混合物，即能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶，在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37℃左右，整個過程一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。RPA檢測的靈敏度很高，能夠?qū)⒑哿考?trace?levels)的核酸(尤其是DNA)模板擴(kuò)增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約1012擴(kuò)增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復(fù)雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實地檢測。目前，RPA反應(yīng)可以通過瓊脂糖凝膠電泳，熒光擴(kuò)增曲線和LFD試紙條三種不同方式檢測結(jié)果，這三種方式的引物與探針反應(yīng)原理是不同的。凝膠電泳和熒光擴(kuò)增曲線法仍然依賴實驗室和特殊儀器設(shè)備，而LFD是一種無需特殊儀器可用于現(xiàn)場的方法。RPA-nfo反應(yīng)的引物與探針的設(shè)計沒有具體的規(guī)則，只能經(jīng)過RPA反應(yīng)后應(yīng)用側(cè)流層析試紙條(LFD)檢測，才能篩選獲得可用于臨床檢測的引物與探針組合。在RPA-nfo正反向引物的擴(kuò)增靶序列中設(shè)計一條帶FAM標(biāo)記的特異探針，同時反向引物用生物素標(biāo)記，生物素標(biāo)記的RPA產(chǎn)物與FAM標(biāo)記的特異探針雜交、FAM標(biāo)記的特異探針與抗FAM抗體的金標(biāo)物結(jié)合后，將該免疫復(fù)合物滴加到試紙條上，免疫復(fù)合物通過層析膜擴(kuò)散，擴(kuò)散到檢測線時，生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物被生物素配體捕獲，形成具有顏色的檢測線，即檢測條帶。不被捕獲的免疫復(fù)合物繼續(xù)擴(kuò)散到質(zhì)控線被特異性抗體所捕獲，形成具有顏色的質(zhì)控線，即對照條帶。當(dāng)RPA技術(shù)與側(cè)流層析技術(shù)結(jié)合后，即RPA-LFD技術(shù)，可以通過側(cè)流層析試紙條(LFD)讀取結(jié)果，本方法既不要求特殊儀器設(shè)備，也無需復(fù)雜的樣品處理，僅僅使用側(cè)流層析試紙就可以通過肉眼觀察結(jié)果。因此，RPA-LFD技術(shù)在結(jié)核病的現(xiàn)場診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種特異、靈敏、簡易、快速的現(xiàn)場檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、坎納分支桿菌)的RPA-LFD引物與探針以及含有該引物與探針的試劑盒。為實現(xiàn)本專利技術(shù)目的，采用如下技術(shù)方案：一種用于現(xiàn)場快速檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物對和探針組合，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探針序列如SEQIDNo.3所示。優(yōu)選的是，所述的核分枝桿菌復(fù)合群包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、坎納分支桿菌。優(yōu)選的是，所述正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探針序列如SEQIDNo.3所示：SEQIDNo.1：5'-GGTTCGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCG-3'SEQIDNo.2：5'-(Biotin)-GAGTCTTGCCCCCCACCCAACCATCCCTGCCAT-3'SEQIDNo.3：5'FAM-CCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCG(dSpacer)CGCTTCGATGGATTC-C3-Spacer3'本專利技術(shù)還提供了一種用于現(xiàn)場快速檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的的試劑盒，該試劑盒包含上述的引物對和探針組合。本專利技術(shù)還提供了一種現(xiàn)場快速檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的方法，包括如下步驟：(1)檢測樣本DNA的提取或檢測樣本裂解處理；(2)以步驟(1)中處理的樣本為模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增；(3)用側(cè)流層析試紙條檢測上述RPA擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測結(jié)果判定樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。優(yōu)選的是，所述RPA擴(kuò)增體系為：RPA反應(yīng)體系為50μL：其中包括10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，10μM的探針0.6μL，rehydration緩沖液29.5μL，待測樣本DNA或粗裂解產(chǎn)物和ddH2O?13.2μL；擴(kuò)增程序為：恒溫水浴鍋38攝氏度反應(yīng)25分鐘。優(yōu)選的是，步驟(3)的具體步驟為：取2μL?RPA擴(kuò)增產(chǎn)物與98μL的LFD檢測緩沖液混合，將LFD置入觀察結(jié)果，在5分鐘內(nèi)，若同時出現(xiàn)檢測條帶和對照條帶，則該樣本結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染陽性，僅出現(xiàn)對照條帶則說明該樣本中不含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群細(xì)菌，如果僅出現(xiàn)檢測條帶或者無條帶則說明RPA-LFD檢測不成立。本專利技術(shù)還提供含有上述引物與探針組合的用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的試劑盒。該試劑盒中還包括大腸桿本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種用于現(xiàn)場快速檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物和探針，其特征在于：其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探針序列如SEQIDNo.3所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于現(xiàn)場快速檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物和探針，其特征在于：其正向引物
序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探針序列如SEQIDNo.3所示。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核分枝桿菌復(fù)合群包括結(jié)核分枝桿菌、
牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、坎納分支桿菌。
3.如權(quán)利要求1所述的引物對和探針組合，其特征在于，所述正向引物序列如
SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探針序列如SEQIDNo.3所示：
SEQIDNo.1：
5'-GGTTCGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCG-3'
SEQIDNo.2：
5'-(Biotin)-GAGTCTTGCCCCCCACCCAACCATCCCTGCCAT-3'
SEQIDNo.3：
5'FAM-CCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCG(dSpacer)
CGCTTCGATGGATTC-C3-Spacer3'。
4.一種用于現(xiàn)場快速檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的試劑盒，其特征在于：該試劑盒包含權(quán)
利要求1所述的引物對和探...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何洪彬，趙貴民，王洪梅，
申請(專利權(quán))人：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37