一種人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性的定量測定方法、試劑及試劑盒技術

本申請涉及一種定量測定人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性的試劑，該試劑由分別放置的試劑I和試劑II組成，其中，所述試劑I含有Tris緩沖液、L-天門冬氨酸、蘋果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、c-AST羊抗人抗體、酶穩(wěn)定劑；所述試劑II含有α-酮戊二酸、還原性輔酶。本發(fā)明專利技術采用的試劑盒及檢測方法只需幾十微升血清，無需離心或電泳等分離處理，操作簡便，可滿足全自動化分析的要求，適用于大規(guī)模樣品的及時準確檢測。

【技術實現步驟摘要】

本申請設及一種人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性的定量測定方法、試 劑及試劑盒。
技術介紹
天冬氨酸氨基轉移酶（Aspartateaminotransferase,AST)廣泛存在于人體各種 組織細胞中，尤W肝、屯、組織細胞含量最為豐富，而正常人血清中AST活性很低。人體中AST 存在兩種同工酶，一種是cAST，主要來源于細胞漿，另一種是mAST，存在于線粒體內。該兩 種同工酶在基因組成上有差異，在氨基酸組成、免疫學特性W及在體內的半衰期等均不同。 在機體輕度病變時，組織細胞的細胞膜通透性增高，CAST透過細胞膜進入血液系 統中，但mAST有兩層線粒體膜的保護，不易釋放入血；而當機體嚴重疾病時，出現細胞壞 死、線粒體崩解，附著在線粒體上的mAST可迅速釋放進入血中。因此，血清mAST活性可反映 組織細胞的壞死程度，若血清中檢測出高水平mAST，則表明屯、肌、肝臟嚴重受損；另外mAST 在血中的半衰期比CAST短，當細胞不再破壞或修復時，血清中mAST很快降至正常水平，因 此mAST又是屯、肌、肝臟損害預后的評價指標，對疾病的診斷、治療具有重要的價值。 目前，血清中mAST測定主要有電泳法、層析法W及免疫抑制法等。該些方法具有 操作繁瑣、耗時長、價格昂貴、過度浪費資源的缺點，不適于常規(guī)檢驗，尤其是大規(guī)模流行病 學檢查或臨床大批量標本諸多項目的同時檢測。
技術實現思路
本申請的目的是提供一種人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性定量測定 方法、試劑及試劑盒。 本申請采用了W下技術方案： 本申請的一方面公開了一種定量測定人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活 性的試劑，該試劑由分別放置的試劑I和試劑II組成，其中，所述試劑I含有Tris緩沖液、 k天口冬氨酸、蘋果酸脫氨酶、乳酸脫氨酶、C-AST羊抗人抗體、酶穩(wěn)定劑；所述試劑II含有 a-酬戊二酸、還原性輔酶。[000引進一步的，所述試劑I中Tris緩沖液含量為50-150mmol/l，k天口冬氨酸含量為 100-500mmol/l，蘋果酸脫氨酶含量為0. 5-2KU/1，乳酸脫氨酶含量為0. 2-1. 5KU/1，C-AST 羊抗人抗體含量為0. 5-1. 5ml/l，酶穩(wěn)定劑含量為0. 5-5g/L。 進一步的，所述試劑I中Tris緩沖液含量為lOOmmol/L，k天口冬氨酸含量為 240mmol/l，蘋果酸脫氨酶含量為化U/1，乳酸脫氨酶含量為0. 8KU/1，C-AST羊抗人抗體含 量為0. 8ml/l，酶穩(wěn)定劑含量為Ig/L。 進一步的，所述試劑II中a-酬戊二酸含量為l-50mmol/l，還原性輔酶含量為 0.05-lmmol/L。 進一步的，所述試劑II中a-酬戊二酸含量為lOmmol/l，還原性輔酶含量為 0.2mmol/L。 進一步的，所述Tris緩沖液PH為8. 0。 進一步的，所述酶穩(wěn)定劑包括海藻糖、庶糖、牛血清白蛋白、甘油、吐溫80中的一 種或者幾種； 進一步的，所述還原型輔酶I穩(wěn)定劑包括海藻糖、牛血清白蛋白、甘油、吐溫80中 的一種或幾種。 本申請的另一方面提供一種定量測定人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活 性的試劑盒，其中裝有上述定量測定人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性的試劑， 該試劑由分別放置的試劑I及試劑II組成。 本申請的另一方面提供一種定量測定人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活 性的方法，該方法包括向血清樣品中加入所述試劑I，37°c解育5分鐘，然后向樣品中加入 試劑II，繼續(xù)解育1-2分鐘后，在340nm波長下連續(xù)監(jiān)測1-2分鐘樣本吸光度變化，計算樣 本每分鐘平均吸光度變化值A/min;用同樣的方法測定空白管每分鐘平均吸光度變化 值AAea/min;再通過下式（1)計算得到血清樣品的線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性： m-AST活性（U/L) = (AA樣本 /min-AA空白 /min)XK(1)[001 引K= 2090 本方法的原理為；血清中天口冬氨酸氨基轉移酶的活性為胞漿型AST(c-AST)和 線粒體型AST (m-AST)之和。本法用免疫抑制法酶動力學測定m-AST活性，在羊抗人的C-AST 抗體存在的條件下，標本中C-AST活性被抑制，而m-AST活性不受影響。可用速率法進行測 定，標本中m-AST的活性與NADH下降的速率呈正比。 本專利技術直接定量測定人血清樣品中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性的試劑盒，是 將分別放置的上述試劑I和試劑IIW不同的規(guī)格裝入試劑盒包裝中。該試劑盒具有多種 不同的規(guī)格，可W分別適用于目前在臨床實驗室普遍使用的各種國內外品牌的自動生化分 析儀器。 本專利技術采用的試劑盒及檢測方法只需幾十微升血清，無需離屯、或電泳等分離處 理，操作簡便，可滿足全自動化分析的要求，適用于大規(guī)模樣品的及時準確檢測?！揪唧w實施方式】 實施例一 按照下述成分和比例配置下述本專利技術試劑I及試劑II : 試劑 I:【主權項】1. 一種定量測定人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性的試劑，該試劑由分別放 置的試劑I和試劑II組成，其中，所述試劑I含有Tris緩沖液、L-天門冬氨酸、蘋果酸脫 氫酶、乳酸脫氫酶、c-AST羊抗人抗體、酶穩(wěn)定劑；所述試劑II含有a -酮戊二酸、還原性輔 酶。2. 根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑I中Tris緩沖液含量為 50-150mmol/L，L-天門冬氨酸含量為100-500mmol/L，蘋果酸脫氫酶含量為0. 5-2KU/L，乳 酸脫氫酶含量為〇. 2-1. 5KU/L，c-AST羊抗人抗體含量為0. 5-1. 5ml/L，酶穩(wěn)定劑含量為 0. 5-5g/L〇3. 根據權利要求2所述的試劑，其特征在于，所述試劑I中Tris緩沖液含量為 100mmol/L，L-天門冬氨酸含量為240mmol/L，蘋果酸脫氫酶含量為1KU/L，乳酸脫氫酶含量 為0. 8KU/L，c-AST羊抗人抗體含量為0. 8ml/L，酶穩(wěn)定劑含量為lg/L。4. 根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑II中a _酮戊二酸含量為 l-50mmol/L，還原性輔酶含量為0. 05-lmmol/L。5. 根據權利要求4所述的試劑，其特征在于，所述試劑II中a-酮戊二酸含量為 10mmol/L，還原性輔酶含量為0. 2mmol/L。6. -種定量測定人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性的試劑盒，其特征在于， 其中裝有權利要求1至5中任一所述的定量測定人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活 性的試劑，該試劑由分別放置的試劑I及試劑II組成。7. -種定量測定人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性的方法，該方法包括向血 清樣品中加入所述試劑I，37°C孵育5分鐘，然后向樣品中加入試劑II，繼續(xù)孵育1-2分鐘 后，在340nm波長下連續(xù)監(jiān)測1-2分鐘樣本吸光度變化，計算樣本每分鐘平均吸光度變化值 A /min ;用同樣的方法測定空白管每分鐘平均吸光度變化值A Aee /min ;再通過下式 (1)計算得到血清樣品的線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性： m-AST 活性（U/L) = ( A A樣本 /min- A A空白 /min) XK (1) K = 2090?！緦＠疚臋n來自技高網...

【技術保護點】
一種定量測定人體血清中線粒體天冬氨酸氨基轉移酶活性的試劑，該試劑由分別放置的試劑I和試劑II組成，其中，所述試劑I含有Tris緩沖液、L?天門冬氨酸、蘋果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、c?AST羊抗人抗體、酶穩(wěn)定劑；所述試劑II含有α?酮戊二酸、還原性輔酶。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：張益軍，
申請(專利權)人：浙江藍森生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33