本發明專利技術公開了一種損傷DNA-納米金復合物及其制備方法、該損傷DNA-納米金復合物在藥物損傷DNA應答蛋白的捕獲和/或鑒定中的應用以及利用該損傷DNA-納米金復合物捕獲藥物損傷DNA應答蛋白的方法，所述損傷DNA-納米金復合物中，1摩爾的納米金上結合有7-12摩爾的藥物損傷的雙鏈DNA。本發明專利技術的損傷DNA-納米金復合物在僅需要少量細胞裂解液即可實現藥物損傷DNA應答蛋白的高特異性捕獲。此外，將本發明專利技術的損傷DNA-納米金復合物用于捕獲藥物損傷DNA應答蛋白時，通過簡單的離心步驟即可將捕獲的藥物損傷DNA應答蛋白與其他蛋白分離，簡化了操作。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于蛋白質富集、分離和檢測領域，具體地，涉及一種損傷DNA-納米金復 合物及其制備方法，該損傷DNA-納米金復合物捕獲藥物損傷DNA應答蛋白的方法，以及該 損傷DNA-納米金復合物在藥物損傷DNA應答蛋白的捕獲和/或鑒定中的應用。
技術介紹
以順鉬為代表的鉬類抗腫瘤藥物是細胞毒性抗腫瘤藥物的典型代表。自1969年 Rosenberg發現順鉬（Cisplatin)抑制細胞生長的生物活性以來，順鉬已成為臨床上使用 最為廣泛的抗腫瘤藥物，第二代鉬類藥物卡鉬、奧沙利鉬等也已相繼進入臨床使用。順鉬 進入人體后，可擴散通過帶電的細胞膜，進入細胞質內，被轉運至細胞核，在染色質內和DNA 形成一種鏈內交聯復合物。高遷移率族蛋白I (HMGB1，high mobility group proteinl) 能特異性地結合順鉬與DNA形成的1，2-d(GpG)鏈內交聯產物，阻止核酸切割酶對DNA的修 復，抑制DNA的轉錄和復制，導致細胞凋亡或壞死。 迄今為止，人們對不同腫瘤細胞對金屬抗腫瘤藥物DNA損傷的分子應答機制及其 差異還知之甚少。所以，從分子水平上研究DNA結合蛋白與損傷DNA-藥物復合物的相互識 別和相互作用，以及這種分子識別作用對細胞藥物應答靈敏度的影響，對深入理解細胞毒 性抗腫瘤藥物的作用機理，進一步優化它們的分子設計具有非常重要的意義，也是藥物發 現領域所面臨的最具挑戰性的課題之一。 目前，捕獲鉬損傷DNA應答蛋白的方法包括：將含有光捕獲基團的鉬損傷DNA負載 到磁珠表面或者將鉬損傷DNA負載到糖球表面與大量的核蛋白溶液孵育以捕獲應答蛋白。 這些方法的主要不足是：由于磁珠或糖球等材料不溶于水，結合過程為非均相結合，所以需 要使用大量的腫瘤細胞裂解液；而且沒有設置對照，易將非特異性捕獲的蛋白質作為應答 蛋白；而且由于引入了光捕獲試劑，鉬損傷DNA的結構并不是生理條件下的結構，因此捕獲 的蛋白不一定是生理條件下的應答蛋白。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術需要大量細胞裂解液且特異性較低的缺陷，提供一 種使用少量細胞裂解液即可實現捕獲且特異性高的損傷DNA-納米金復合物及其制備方 法、該損傷DNA-納米金復合物捕獲藥物損傷DNA應答蛋白的方法以及該損傷DNA-納米金 復合物在藥物損傷DNA應答蛋白的捕獲和/或鑒定中的應用。 為了實現上述目的，第一方面，本專利技術提供了一種損傷DNA-納米金復合物，該損 傷DNA-納米金復合物中，1摩爾的納米金上結合有7-12摩爾的藥物損傷的雙鏈DNA。 第二方面，本專利技術提供了一種制備第一方面所述的損傷DNA-納米金復合物的方 法，該方法包括將藥物損傷的雙鏈DNA與納米金接觸，以使藥物損傷的雙鏈DNA與納米金相 連。 第三方面，本專利技術提供了由第二方面所述的方法制得的損傷DNA-納米金復合物。 第四方面，本專利技術提供了一種捕獲藥物損傷DNA應答蛋白的方法，該方法包括以 下步驟： (1)將第一方面和/或第三方面所述的損傷DNA-納米金復合物（也稱為陽性探 針)、沒有被藥物損傷的對照DNA-納米金復合物(也稱為對照探針)與細胞裂解液混合，以使 損傷DNA-納米金復合物與藥物損傷DNA應答蛋白結合，所述對照DNA-納米金復合物中，1 摩爾的納米金上結合有7-12摩爾的雙鏈DNA，所述對照DNA-納米金復合物中的雙鏈DNA與 所述損傷DNA-納米金復合物中的藥物損傷的雙鏈DNA的堿基序列相同； (2)除去未結合的蛋白，從而分離出捕獲的蛋白； (3)鑒定捕獲的蛋白； (4)應用基于穩定同位素標記的定量蛋白質組學方法對捕獲的蛋白進行定量比 較，排除非特異性的DNA結合蛋白，從而得到特異性識別藥物損傷DNA的應答蛋白。 第五方面，本專利技術提供了第一方面和/或第三方面所述的損傷DNA-納米金復合物 在藥物損傷DNA應答蛋白的捕獲和/或鑒定中的應用。 通過上述技術方案，本專利技術的損傷DNA-納米金復合物僅需要少量細胞裂解液即 可實現藥物損傷DNA應答蛋白的捕獲，且蛋白捕獲特異性高。此外，將本專利技術的損傷DNA-納 米金復合物用于捕獲藥物損傷DNA應答蛋白時，通過簡單的離心步驟即可將捕獲的藥物損 傷DNA應答蛋白與其他蛋白分離，簡化了操作。 本專利技術的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。【附圖說明】 附圖是用來提供對本專利技術的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本專利技術，但并不構成對本專利技術的限制。在附圖中： 圖1為按照實施例1的方法制得的順鉬損傷DNA-納米金復合物探針的透射電鏡 照片（圖1A)及紫外吸收光譜表征圖（圖1B); 圖2為按照實施例1的方法制得的順鉬損傷DNA-納米金復合物探針從MCF-7細 胞裂解液中捕獲到的蛋白HMGBl的胰蛋白酶酶解肽段的二級質譜圖； 圖3為按照實施例1的方法制得的順鉬損傷DNA-納米金復合物探針從MCF-7細 胞裂解液中捕獲到的蛋白HMGBl的Western Blot結果圖，從左往右依次是細胞裂解液中的 HMGBl (分子量為25KD)，陽性探針捕獲到的HMGBl ; 圖4為實施例2中的陽性探針和對照探針從MCF-7細胞裂解液中捕獲到的HMGBl 的胰蛋白酶酶解肽段的質譜定量結果； 圖5為按照實施例3的方法制得的反式鉬噻唑化合物（trans-PtTz)損傷DNA-納 米金復合物探針從MCF-7細胞裂解液中捕獲到的蛋白TCP4的胰蛋白酶酶解肽段的二級質 譜圖； 圖6為實施例4中的陽性探針和對照探針從MCF-7細胞裂解液中捕獲到的TCP4 的胰蛋白酶酶解肽段的質譜定量結果。【具體實施方式】 以下對本專利技術的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本專利技術，并不用于限制本專利技術。 在本專利技術中，在未作特殊說明的情況下，術語"藥物損傷的雙鏈DNA"是指雙鏈DNA 與能夠共價或配位結合DNA的藥物接觸后，雙鏈DNA中的至少一條鏈與所述藥物相結合而 形成的交聯產物，即，是共價或配位結合有藥物的雙鏈DNA，需要說明的是，結合藥物并不會 改變雙鏈DNA的堿基序列；"藥物損傷DNA應答蛋白"是指能夠特異性地結合藥物損傷的雙 鏈DNA的蛋白質，部分藥物損傷DNA應答蛋白可以修復損傷的DNA，導致細胞對藥物產生耐 受性,也有一部分藥物損傷DNA應答蛋白可以阻止損傷DNA被修復，從而增加腫瘤細胞對藥 物的敏感性。 本專利技術提供的損傷DNA-納米金復合物中，1摩爾的納米金上結合有7-12摩爾的藥 物損傷的雙鏈DNA。 根據本專利技術，對所述雙鏈DNA沒有特別的要求，可以為各種能夠與抗腫瘤藥物形 成鏈內交聯復合物從而抑制腫瘤細胞生長的雙鏈DNA。優選地，所述藥物損傷的雙鏈DNA的 長度為9-45bp，結合有藥物的鏈中間具有1-2個鳥嘌呤。例如，當抗腫瘤藥物為順鉬時，可 以使用兩條鏈的喊基序列分別如下所不的雙鏈DNA : 5, -CCTCTCTGGACCTTCC-3' （SEQ ID N0:1) 5' -GGAAGGTCCAGAGAGG-3' （SEQ ID N0:2) 需要說明的是，藥物損傷的雙鏈DNA中，各種常規藥物與雙鏈DNA的結合方式為本 領域技術人員所熟知，在此不再贅述。 根本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種損傷DNA?納米金復合物，其特征在于，該損傷DNA?納米金復合物中，1摩爾的納米金上結合有7?12摩爾的藥物損傷的雙鏈DNA。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：汪福意，杜支鳳，羅群，郭偉，
申請(專利權)人：中國科學院化學研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11
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