本發明專利技術公開了一種測定大豆凝集素凝集活性的微膠珠ELISA試劑盒，包括：1)保存于濃度為20％酒精中的微凝膠；2)大豆凝集素抗體；3)抗體稀釋劑PBST；4)有篩板的小管；5)辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體；6)終止液。本發明專利技術利用共價鍵將大豆凝集素與凝集相關的特異性結合物連接至膠珠上，從而獲得了耐酸，耐堿，耐鹽，能夠穩定保存的ELISA固相載體，具有操作簡單、方便、靈敏度高的特點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物成分檢測
，具體設及一種測定大豆凝集素凝集活性的微 膠珠化ISA試劑盒。
技術介紹
大豆種質資源豐富，蛋白質含量較高且氨基酸比例較平衡，是動物優質的植物性 蛋白質飼料來源。但是大豆中含有多種抗營養因子，包括膜蛋白酶抑制因子、凝集素、異黃 酬、抗原蛋白等。該些抗營養因子通過干擾動物對營養物質的消化、吸收和代謝等多種方式 危害人和動物尤其是幼齡動物的生長和健康。大豆凝集素是大豆中主要的抗營養因子之 一，在成熟種子中約占大豆蛋白總含量的10%，其含量在一定程度上抑制了大豆的廣泛應 用，因此建立大豆凝集素活性的靈敏、快速的檢測方法引起研究者的關注。 現有的大豆凝集素檢測方法，按照檢測目的不同可W分為兩類，一是檢測免疫學 活性的免疫化學分析方法，二是檢測凝集活性的兔血凝抑制實驗W及功能性化ISA方法。 最為成熟的凝集活性檢測方法是兔血凝抑制實驗，其優點是檢測設備簡單，價格低廉，缺點 是測定結果不宜觀察（需要一定的經驗才能判斷準確）、檢測準確性低、重復性差W及需要 新鮮的兔紅細胞。基于上述缺點，張海泉等建立了功能性化ISA方法，W提高檢測的準確 性，但是檢測的重復性仍然較差，而且需要準備新鮮的兔紅細胞外殼給實際檢測帶來了極 大不便。因此本申請建立了全新的微膠珠化ISA方法替代W往采用的兔血凝抑制實驗實驗 和功能性化ISA方法。
技術實現思路
本專利技術針對現有技術存在的缺陷，目的在于提供一種測定大豆凝集素凝集活性的 微膠珠化ISA試劑盒，本專利技術利用共價鍵將大豆凝集素與凝集相關的特異性結合物連接至 膠珠上，從而獲得了耐酸，耐堿，耐鹽，能夠穩定保存的化ISA固相載體，可W替代W往采用 的兔血凝抑制實驗和功能性化ISA方法。 本專利技術具體通過W下技術方案實現： 一種測定大豆凝集素凝集活性的微膠珠化ISA試劑盒，包括： 1)保存于濃度為20 %酒精中的微凝膠；[000引 2)大豆凝集素抗體（凍干粉）； 3)抗體稀釋劑PBST; 4)有篩板的小管； 5)辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體；[001引 6)終止液（11. 1血濃硫酸，88. 9血水）。[001引本專利技術所述的微凝膠通過W下方法制備；1)將瓊脂糖配制成4%的溶液，利用噴 射方法制得瓊脂糖凝膠珠，利用柱管式分流裝置進行分級得到微膠株；2)取11ml瓊脂糖微 膠株用500ml蒸饋水洗漆，抽干加15ml0. 8moVI的化OH，4ml環氧氯丙烷，20mg棚氨化鋼， 在水浴搖床上25°C輕搖她，用冰水清洗活化凝膠，真空抽去多余的環氧氯丙烷；3)取半乳 糖溶于pH9. 00. 25M碳酸鋼緩沖液制成半乳糖溶液，將半乳糖溶液與洗凈的凝膠混合，在搖 床上振蕩，25°C偶聯20小時，用20倍微球體積的生理鹽水清洗微球，將清洗后的微球置于 4C保持，待用。 本專利技術所述的大豆凝集素抗體為多克隆抗體的凍干粉。所述的抗體稀釋劑為；9g化Cl，2.9g化2冊〇4,0.3gNa&PO"定容至1000血，加0. 5血吐溫20。 所述的終止液為；11. 1血濃硫酸和88. 9血水配置得到。 本專利技術所述的試劑盒報包括大豆凝集素標準品。[001引本專利技術所述的試劑盒的通過W下步驟進行檢測： 1)微凝膠置于1ml有篩板的小管，將待測樣品滴到有微凝膠的小管中，解育化，用 稀釋劑沖洗； 2)加入用稀釋劑稀釋抗大豆凝集素抗體，在37°C溫箱內培養化后，用稀釋劑沖 洗； 3)在小管加入辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體，在37°C溫箱內培養化，用稀 釋劑沖洗； 4)加入底物培養lOmin后，滴加終止液，反應終止，測490皿處光密度值。 所述的大豆凝集素抗體與稀釋劑的稀釋比例為l:800v/v。 所述加入的辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體用稀釋劑稀釋1000倍。 本專利技術的有益效果為：本專利技術利用共價鍵將大豆凝集素與凝集相關的特異性結合 物連接至膠珠上，從而獲得了耐酸，耐堿，耐鹽，能夠穩定保存的化ISA固相載體，可W替代 W往采用的兔血凝抑制實驗和功能性化ISA方法，全新的微膠珠化ISA方法解決了W往方 法存在的弊端。【具體實施方式】 下面結合實施例對本專利技術做進一步的說明，W下所述，僅是對本專利技術的較佳實施 例而已，并非對本專利技術做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的
技術實現思路
加W變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本專利技術方案內容，依據本專利技術 的技術實質對W下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本專利技術的保護范圍內。 實施例1[002引 1)瓊脂糖微膠株的制備：將瓊脂糖配制成4%的溶液后，利用噴射方法制得瓊脂 糖凝膠珠，利用柱管式分流裝置進行分級得到微膠株。 2)微膠株的活化：取11ml瓊脂糖微膠株用500ml蒸饋水洗漆，放在G3漏斗中抽 干加15ml0. 8mol/l的PM)H，4ml環氧氯丙烷，20mg棚氨化鋼。在水浴搖床上25°C輕搖她。 用大量的冰水清洗活化凝膠，真空抽去多余的環氧氯丙烷。 3)大豆凝集素特異性配基的偶聯；取半乳糖溶于pH9. 00. 25M碳酸鋼緩沖液制 成半乳糖溶液；將半乳糖溶液與洗凈的凝膠混合，在搖床上振蕩，25°C偶聯20小時；用 0. 5mol/L的磯酸鋼溶液（pH7. 5)清洗微球2次。用Imol/LNaCl溶液和0. 05mol/L磯酸鋼 溶液（pH7.W清洗微球兩次。加10倍體積的lOOmmol/L己醇胺（PH7. 5)，室溫下解育化或 4°C過夜，輕輕搖勻。PBS洗2次。 4)標準品的制備與鑒定大豆凝集素粗提液的制備；將48g脫脂豆粉溶于500血0. 9 %的化C1 (pH7. 2)中， 磁力攬拌器攬拌約兩個小時后，離屯、取上清液，用0. 45ym濾膜過濾，（大約500血）W備上 樣。[003引分離提純；平衡；將柱子用0. 9%的化C1平衡兩個柱床體積（約200血）。上樣； 將上述粗提液上樣（兩個多小時），注意；瓶內大約剩10mlW內就可W換生理鹽水洗，防 止柱子干。洗雜蛋白；上樣后，用0.9%的化C1 (抑7.2)洗脫雜蛋白，至基線。洗脫凝集 素；換用0. 3M半乳糖洗脫凝集素，并用自動收集器收集洗脫液，直至基線，換用0. 9 %的 化Cl(pH7. 2)再平衡。 透析與濃縮；將部分收集器的試管中的液體倒入透析袋中，并用透析夾夾好，放入 含有0. 9%的化C1的溶液中透析。可用磁力攬拌器攬拌每半小時換液，約3-4次即可。后 用聚己二醇濃縮。濃縮后將液體倒入50ml離屯、管中，測0D280和0D260的值，放入-20°C凍 存。 純度檢測：經SDS-PAGE檢測，得到大豆凝集素標準品達到99% W上的純度。 5)大豆凝集素抗血清的制備；健康雄性兔子=只，購自吉林省公主嶺，動物許可 證號；，要求年齡、胎次、體重（約2.化g)。分別免疫大豆凝集素標品。飼養階段在吉林農 業大學動物科技學院動物室進行。采用甲醒熏蒸方式消毒兔舍，待異味完全釋放后再進兔 子，保持室內干凈，空氣清新。兔子單籠飼養，自由采食、飲水。日糧配置參考GB14924-94 實驗動物營養需要及飼養成分表（中國飼料數據庫，1994年修訂版）制訂，且每日補飼胡蘿 h、綠菜葉等。 抗原；親和層析方法提純的大豆凝集素。[003引試劑；弗氏完全佐本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種測定大豆凝集素凝集活性的微膠珠ELISA試劑盒，其特征在于包括：1)保存于濃度為20％酒精中的微凝膠；2)大豆凝集素抗體；3)抗體稀釋劑PBST；4)有篩板的小管；5)辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體；終止液；所述的微凝膠通過以下方法制備：1)將瓊脂糖配制成4％的溶液，利用噴射方法制得瓊脂糖凝膠珠，利用柱管式分流裝置進行分級得到微膠株；2)取11ml瓊脂糖微膠株用500ml蒸餾水洗滌，抽干加15ml0.8mol/l的NaOH，4ml環氧氯丙烷，20mg硼氫化鈉，在水浴搖床上25℃輕搖8h，用冰水清洗活化凝膠，真空抽去多余的環氧氯丙烷；3)取半乳糖溶于pH9.00.25M碳酸鈉緩沖液制成半乳糖溶液，將半乳糖溶液溶液與洗凈的凝膠混合，在搖床上振蕩，25℃偶聯20小時，用20倍微球體積的生理鹽水清洗微球，將清洗后的微球置于4℃保持，待用。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：鮑男，趙元，隋玉健，李愛科，韓飛，陳曦，王好，車東升，
申請(專利權)人：吉林農業大學，
類型：發明
國別省市：吉林;22
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