一種用于結(jié)直腸癌輔助診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了基于與結(jié)直腸癌相關(guān)的基因PCDHB3而開(kāi)發(fā)得到的一種用于結(jié)直腸癌輔助診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒，該試劑盒包括以下試劑中的至少一種：用于檢測(cè)PCDHB3基因表達(dá)水平的引物對(duì)、用于檢測(cè)PCDHB3基因甲基化水平的引物對(duì)、用于檢測(cè)PCDHB3蛋白含量的試劑。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，發(fā)現(xiàn)了位于人類(lèi)染色體5q31的PCDHB3是一個(gè)與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的基因。PCDHB3的mRNA和蛋白表達(dá)水平在結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織中顯著下調(diào)，而該下調(diào)與基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG堿基高度甲基化密切相關(guān)。同時(shí)，在TNM?III-IV期結(jié)直腸癌病人中的預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，PCDHB3在腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)或腫瘤細(xì)胞核膜表達(dá)指示良好預(yù)后。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)屬于分子診斷領(lǐng)域，具體涉及基于與結(jié)直腸癌相關(guān)的基因 PCDHB3而開(kāi)發(fā) 得到的一種用于結(jié)直腸癌輔助診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒。
技術(shù)介紹
目前，結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤之一，每年的新發(fā)病例數(shù)超過(guò)百萬(wàn)，死 亡人數(shù)超過(guò)60萬(wàn)。在中國(guó)，結(jié)直腸癌死亡率為7. 25/10萬(wàn)，僅次于肺癌、肝癌、胃癌和食管 癌。近年來(lái)，隨著我國(guó)人民生活水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)改變、缺乏運(yùn)動(dòng)、吸煙等因素，結(jié)直腸 癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，特別是在沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的大中城市，結(jié)直腸癌發(fā)病率已達(dá)到甚至超 過(guò)西方發(fā)達(dá)國(guó)家的平均水平，成為惡性腫瘤死亡的重要原因，嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康。 nCC/AJCC將結(jié)直腸癌??Μ分期分為I-IV四期。其中I期癌腫未穿出深肌層，沒(méi) 有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；II期癌腫侵犯漿膜層，亦可侵入漿膜外或腸外周?chē)M織，但尚能整塊 切除，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；III期癌腫侵犯腸壁全層或未侵犯全層，但伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；IV期癌 腫伴有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移、局部廣泛浸潤(rùn)或淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移，不能根治性切除。 在臨床治療中，結(jié)直腸癌m、iv期患者由于發(fā)生了淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，往往預(yù)后較 差；并且即使同是處于結(jié)直腸癌I-II期的病人，其臨床預(yù)后也不一樣，表現(xiàn)為手術(shù)及輔助 治療后患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)或生存的時(shí)間不同，導(dǎo)致預(yù)后差異明顯。然而，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展 是一個(gè)涉及多步驟、多基因的復(fù)雜過(guò)程。由于腫瘤異質(zhì)性的存在，臨床工作中常常遇到病理 分期相同而預(yù)后差異明顯的情況。因此，尋找新的輔助診斷和/或判斷預(yù)后的分子指標(biāo)，作 為對(duì)結(jié)直腸癌1'匪病理分期系統(tǒng)的有益補(bǔ)充已成為研宄重點(diǎn)。 PCDHB3 基因（protocadherin^ 3，Gene ID :56132)作為 PCDH 家族中 β 亞家族的 一份子，其編碼的蛋白質(zhì)由6個(gè)胞外cadherin結(jié)構(gòu)域和一次跨膜結(jié)構(gòu)組成。對(duì)P⑶H家族 的研宄表明，該類(lèi)蛋白主要涉及胚胎時(shí)期胎兒形態(tài)發(fā)生發(fā)育和成人大腦中的選擇性神經(jīng)連 接的維持。一些腫瘤研宄曾報(bào)道PCDH家族分子在癌癥中的功能，如在Wilm' s腫瘤中發(fā)現(xiàn) 所有PCDH基因存在啟動(dòng)子高度甲基化；PCDHlO在多種腫瘤中由于被高度甲基化而表達(dá)沉 默，被認(rèn)為是一個(gè)潛在的抑癌基因；PCDH24在結(jié)直腸癌HCTl 16細(xì)胞系中可以導(dǎo)致細(xì)胞接觸 抑制，從而在體外實(shí)驗(yàn)中完全阻滯腫瘤形成，而這種作用可能是通過(guò)負(fù)調(diào)控fct通路而達(dá) 到的，但目前尚無(wú) PCDHB3的有關(guān)報(bào)道。因此，明確PCDHB3與結(jié)直腸癌診斷和/或預(yù)后之間 的關(guān)系，可能對(duì)結(jié)直腸癌個(gè)體化治療具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種用于結(jié)直腸癌輔助診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒。 本專(zhuān)利技術(shù)的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種用于結(jié)直腸癌輔助診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒，所述試劑盒包括試劑A、試 劑B、試劑C或試劑D中的至少一種： 試劑A :用于檢測(cè)K：DHB3基因表達(dá)水平的引物對(duì)，為以下引物中的任意一對(duì)： 引物I :其序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示； 引物 2 :其序列如 SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 所示； 引物 3 :其序列如 SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 所示； 引物 4:其序列如 SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18 所示； 引物 5 :其序列如 SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:20 所示； 引物 6 :其序列如 SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 所示； 引物 7 :其序列如 SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 所示； 引物 8 :其序列如 SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26 所示； 引物 9 :其序列如 SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:28 所示； 引物 10 :其序列如 SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:30 所示； 引物 11 :其序列如 SEQ ID N0:31 和 SEQ ID N0:32 所示； 引物 12 :其序列如 SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34 所示； 引物 13 :其序列如 SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36 所示； 引物 14 :其序列如 SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38 所示； 引物 15 :其序列如 SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40 所示； 試劑B :用于檢測(cè)K：DHB3基因甲基化水平的引物對(duì)，為以下引物中的任意一對(duì)： 引物 16 :其序列如 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 所示； 引物 17 :其序列如 SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42 所示； 試劑C :用于檢測(cè)K：DHB3基因甲基化水平的兩對(duì)引物，其序列分別如SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 所示； 試劑D :用于檢測(cè)K：DHB3蛋白含量的試劑。 所述用于檢測(cè)K：DHB3基因表達(dá)水平的引物是指用于在PCR中合成K：DHB3基因 cDNA鏈的PCR引物。 所述用于檢測(cè)K：DHB3基因甲基化水平的引物是指用于在MSP、BSP中合成K：DHB3 基因啟動(dòng)子甲基化島DNA鏈的PCR引物。 所述用于檢測(cè)K：DHB3蛋白含量的試劑包括抗K：DHB3蛋白的抗體。 通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與正常腸上皮組織相比，PO)HB3 (protocadherin β 3，Gene ID : 56132)蛋白在腫瘤細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，P⑶ΗΒ3啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中呈高度甲基化；因 此，對(duì)腸上皮組織中PCDHB3表達(dá)水平和其啟動(dòng)子甲基化水平的檢測(cè)可用于結(jié)直腸癌的檢 測(cè)； 所述的低水平表達(dá)是指腫瘤細(xì)胞內(nèi)rcDHB3mRNA及蛋白表達(dá)水平低于正常對(duì)照； 所述的高度甲基化是指在腫瘤細(xì)胞內(nèi)PCDHB3啟動(dòng)子CpG堿基甲基化程度高于正常對(duì)照；所 述的腫瘤細(xì)胞為T(mén)NM I-IV期結(jié)直腸癌病人腫瘤組織細(xì)胞。 通過(guò)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)：P⑶HB3在腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)指示良好預(yù)后；P⑶HB3在腫瘤細(xì) 胞核膜表達(dá)指示良好預(yù)后。因此，對(duì)PCDHB3表達(dá)水平及PCDHB3是否在核膜中表達(dá)的檢測(cè) 可用于結(jié)直腸癌的預(yù)后判斷。 所述的高水平表達(dá)是指H-SCORE評(píng)分多1. 57 ;H-SC0RE指免疫組織化學(xué)染色強(qiáng) 度X陽(yáng)性率；所述的核膜表達(dá)是指在腫瘤細(xì)胞核膜上有PCDHB3免疫組織化學(xué)染色；良好 預(yù)后具體為腫瘤細(xì)胞核膜表達(dá)POTHB3病人總生存期、無(wú)進(jìn)展生存期比腫瘤細(xì)胞核膜不表 達(dá)TCDHB3病人長(zhǎng)。所述腫瘤細(xì)胞為T(mén)NM III-IV期結(jié)直腸癌病人腫瘤組織細(xì)胞。 本專(zhuān)利技術(shù)相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果： 本專(zhuān)利技術(shù)通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，發(fā)現(xiàn)了位于人類(lèi)染色體5q31的 P⑶HB3是一個(gè)與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的基因。K：DHB3的mRNA和蛋白表達(dá)水平在結(jié)直腸癌病 人的腫瘤組織中顯著下調(diào)，而該下調(diào)與基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG堿基高度甲基化密切相關(guān)。同 時(shí)，在TNM III-IV期結(jié)直腸癌病人中的預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，PCDHB3在腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)或腫 瘤細(xì)胞核膜本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于結(jié)直腸癌輔助診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括試劑A、試劑B、試劑C或試劑D中的至少一種：試劑A：用于檢測(cè)PCDHB3基因表達(dá)水平的引物對(duì)，為以下引物中的任意一對(duì)：引物1：其序列如SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示；引物2：其序列如SEQ?ID?NO:13和SEQ?ID?NO:14所示；引物3：其序列如SEQ?ID?NO:15和SEQ?ID?NO:16所示；引物4：其序列如SEQ?ID?NO:17和SEQ?ID?NO:18所示；引物5：其序列如SEQ?ID?NO:19和SEQ?ID?NO:20所示；引物6：其序列如SEQ?ID?NO:21和SEQ?ID?NO:22所示；引物7：其序列如SEQ?ID?NO:23和SEQ?ID?NO:24所示；引物8：其序列如SEQ?ID?NO:25和SEQ?ID?NO:26所示；引物9：其序列如SEQ?ID?NO:27和SEQ?ID?NO:28所示；引物10：其序列如SEQ?ID?NO:29和SEQ?ID?NO:30所示；引物11：其序列如SEQ?ID?NO:31和SEQ?ID?NO:32所示；引物12：其序列如SEQ?ID?NO:33和SEQ?ID?NO:34所示；引物13：其序列如SEQ?ID?NO:35和SEQ?ID?NO:36所示；引物14：其序列如SEQ?ID?NO:37和SEQ?ID?NO:38所示；引物15：其序列如SEQ?ID?NO:39和SEQ?ID?NO:40所示；試劑B：用于檢測(cè)PCDHB3基因甲基化水平的引物對(duì)，為以下引物中的任意一對(duì)：引物16：其序列如SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6所示；引物17：其序列如SEQ?ID?NO:41和SEQ?ID?NO:42所示；試劑C：用于檢測(cè)PCDHB3基因甲基化水平的兩對(duì)引物，其序列分別如SEQ?ID?NO:9和SEQ?ID?NO:10、SEQ?ID?NO:11和SEQ?ID?NO:12所示；試劑D：用于檢測(cè)PCDHB3蛋白含量的試劑。...

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃文林，葉文，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：黃文林，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東;44