本實用新型專利技術公開了一種微片式單細胞克隆分離培養板，培養板包括培養板本體，所述培養板本體上表面設有若干方形培養孔，每個培養孔內放置若干呈矩陣排列的方形培養片，本實用新型專利技術所述方形培養孔的底面和四壁、以及方形培養片的底面、周緣、凸起及頂面的周邊均覆蓋有超疏水納米層，細胞只能在方形培養片的上表面經過親水改性的中心區粘附生長，而不能在覆蓋有超疏水納米層其它部位粘附生長，經過有限稀釋的細胞粘附于方形培養片的上表面經過親水改性的中心區后，只要每個方形培養片只有一個細胞克隆生長，即可根據編號，用鑷子夾住相應方形培養片的凸起，可方便的進行單細胞克隆的分離操作。
【技術實現步驟摘要】
本技術涉及單細胞克隆的培養分離，特別涉及一種微片式單細胞克隆分離培養板及單細胞克隆分離方法。
技術介紹
單細胞克隆指的是分離單個細胞，其增殖產生的后代都是來源于同一個細胞，即為單細胞克隆。傳統的單細胞克隆分離可采用有限稀釋法或克隆環法。有限稀釋法:即把細胞稀釋到理論上的5~10 μ I培養液中含I個細胞，然后用移液器吸取相應容積的細胞懸液至96孔板中，每孔補足培養液至200 μ 1，在顯微鏡下找到有單細胞克隆生長的培養孔，進行單細胞克隆分離。實際的操作中，該法效率不高，大量存在的空白孔和多細胞孔(細胞數大于或等于2)需要研宄人員觀察排除，費時費力。克隆環法:在顯微鏡下找到要挑取的單克隆，用記號筆在培養板的背面標示出來。用鑷子夾取克隆環，在環的底部均勻的涂上凡士林，扣在標記的單克隆上，形成相對封閉的空間，然后在克隆環內滴入適量的胰酶，細胞消化下來后用槍頭吸出，放到新的培養板中培養。該方法對操作技巧要求較高，初學者不易掌握。
技術實現思路
為克服上述現有方法的缺陷與不足，本技術提供一種微片式單細胞克隆分離專用培養板及單細胞克隆分離方法。本技術的技術方案是:一種微片式單細胞克隆分離培養板，包括培養板本體，所述培養板本體上表面設有若干方形培養孔，每個培養孔內放置若干呈矩陣排列的方形培養片，培養板本體上方蓋有培養板蓋。優選的，所述培養板本體為聚苯乙烯板。優選的，所述方形培養片上表面邊角處設有凸起。優選的，所述方形培養片的上表面中心區為細胞貼壁培養區，細胞貼壁培養區聚苯乙烯表面進行過改性處理，接枝羥基、羧基或氨基等親水基團。優選的，所述方形培養孔的底面和四壁以及方形培養片的細胞貼壁培養區以外的表面覆蓋有超疏水納米層。優選的，所述超疏水納米層為具有超疏水表面的聚苯乙稀層、聚L-乳酸層、聚四氟乙烯層、陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜中的一種。優選的，所述方形培養片底面標有字母和數字組成的組合編號。一種使用微片式單細胞克隆分離培養板進行單細胞克隆分離的方法，包括步驟:S1、將細胞懸液濃度稀釋至30~50 cells/ml，在培養板的方形培養孔內加入定量的細胞稀釋液，細胞只能在方形培養片上表面的經過表面親水改性處理的細胞貼壁培養區粘附生長，而不能在其它經過超疏水處理的部位粘附生長；S2、每天在顯微鏡下觀察方形培養片內的細胞，選擇有單細胞克隆生長的方形培養片，根據其編號，用鑷子夾起方形培養片上的凸起，無菌轉移至24孔板的培養孔中；S3、將生長有單細胞克隆的方形培養片依次在3個培養孔中用PBS輕柔漂洗3次，轉移至第四個孔中，加入0.25%的胰酶消化細胞；S4、收集消化好的單細胞懸液，經PBS重懸，在100rpm轉速下離心lOmin，獲取細胞沉淀，再次在100rpm轉速下離心lOmin，獲取細胞沉淀，用完全培養基重懸，將細胞轉移至新的24孔板中，繼續擴大培養，所得即為單細胞克隆。優選的，所述方形培養片預先通過可溶性生物材料粘附在方形培養孔內，可溶性生物材料在加入培養液后可溶解，使方形培養片與方形培養孔分開。優選的，所述可溶性生物材料包括膠原、牛血清白蛋白、人血白蛋白、胎牛血清蛋白和小牛血清蛋白。本技術的優點是:本技術所述的微片式單細胞克隆分離專用培養板及單細胞克隆分離方法，培養板本體上表面設有若干個方形培養孔，每個培養孔內放置呈矩陣排列的方形培養片，所述方形培養孔的底面和四壁、以及方形培養片的底面、周緣、凸起及頂面的周邊均覆蓋有超疏水納米層，細胞只能在方形培養片的上表面經過親水改性的中心區粘附生長，而不能在覆蓋有超疏水納米層其它部位粘附生長，經過有限稀釋的細胞粘附于方形培養片的上表面經過親水改性的中心區后，只要每個方形培養片只有一個細胞克隆生長，即可根據編號，用鑷子夾住相應方形培養片的凸起，可方便的進行單細胞克隆的分離操作。【附圖說明】下面結合附圖及實施例對本技術作進一步描述:圖1為本技術所述的微片式單細胞克隆分離培養板的培養板本體的俯視圖；圖2為本技術所述的方形培養片的結構示意圖；圖3為本技術所述的方形培養片的俯視結構示意圖；圖4為本技術所述的微片式單細胞克隆分離培養板蓋上培養板蓋的整體結構示意圖。【具體實施方式】如圖1和4所示，本技術所揭示的微片式單細胞克隆分離培養板，包括由聚苯乙烯制成的培養板本體I，所述培養板本體上表面設有6個方形培養孔2，每個培養孔內放置1X 10 (方形培養片的矩陣排列方式也可以為7X7、8X8、9X9或其它組合方式)呈矩陣排列的方形培養片3，培養板本體上方蓋有培養板蓋4。如圖2和3所示，所述方形培養片3上表面右上方的邊角設有凸起31，方便用鑷子夾起，方形培養片底面標有字母和數字組成的組合編號，字母代表該方形培養片所在行，數字代表該方形培養片所在列，方便區分。所述方形培養片的上表面中心區為細胞貼壁培養區32，將細胞貼壁培養區聚苯乙烯表面進行改性處理，接枝羥基(OH)，或者羧基(COOH)，或者氨基(NH或NH2)等親水基團。所述方形培養片除上表面中心區為細胞貼壁培養區外，其它部位的聚苯乙烯區表面覆蓋有超疏水納米層。超疏水納米層為具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料，超疏水納米層還可以為超疏水的陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜，上述超疏水納米層的制作方法為現有技術采用的方法，例如在聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料表面蝕刻具有一定粗糙度的微觀結構從而構建超疏水表面，采用氣相沉積的方法制備超疏水的陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜。本技術的使用微片式單細胞克隆分離專用培養板進行單細胞克隆分離的方法，包括步驟:S1、將細胞懸液濃度稀釋至30~50 cells/ml，在培養板的方形培養孔內加入2 ml的細胞稀釋液，細胞只能在方形培養片上表面的經過表面親水改性處理的細胞貼壁培養區粘附生長，而不能在其它經過超疏水處理的部位粘附生長；S2、每天在顯微鏡下觀察方形培養片內的細胞，選擇有單細胞克隆生長的方形培養片，根據其編號，用鑷子夾起方形培養片上的凸起，無菌轉移至24孔板的培養孔中；S3、將生長有單細胞克隆的方形培養片依次在3個培養孔中用PBS輕柔漂洗3次，轉移至第四個孔中，加入0.25%的胰酶消化細胞；S4、收集消化好的單細胞懸液，經PBS重懸，在100rpm轉速下離心lOmin，獲取細胞沉淀，再次在100rpm轉速下離心lOmin，獲取細胞沉淀，用完全培養基重懸，將細胞轉移至新的24孔中，繼續擴大培養，所得即為單細胞克隆。所述方形培養片預先通過可溶性生物材料粘附在方形培養孔內，可溶性生物材料在加入培養液后可溶解，使方形培養片與方形培養孔分開。所述可溶性生物材料包括膠原、牛血清白蛋白、人血白蛋白、胎牛血清蛋白和小牛血清蛋白。上述實施例只為說明本技術的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人能夠了解本技術的內容并據以實施，并不能以此限制本技術的保護范圍。凡根據本技術主要技術方案的精神實質所做的修飾，都應涵蓋在本技術的保護范圍之內。【主權項】1.一種微片式單細胞克隆分離培養板，其特征在于:包括培養板本體，所述培養板本體上表面設有若干方形培養孔，每個培養孔內放置若干呈矩陣排列的方形培養片，培養本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種微片式單細胞克隆分離培養板，其特征在于：包括培養板本體，所述培養板本體上表面設有若干方形培養孔，每個培養孔內放置若干呈矩陣排列的方形培養片，培養板本體上方蓋有培養板蓋。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：何向鋒，施文，王建紅，強福林，沈康，
申請(專利權)人：何向鋒，南通市腫瘤醫院，
類型：新型
國別省市：江蘇;32
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。