殘粒樣脂蛋白膽甾醇的定量方法及用于其的試劑盒技術

本發明專利技術涉及殘粒樣脂蛋白(RLP)中的膽甾醇的定量方法及用于其的試劑盒。公開了用于不需要分離操作而簡便、且準確地定量待測物試樣中的殘粒樣脂蛋白膽甾醇的方法及用于該方法的試劑盒。含有包含殘粒樣脂蛋白的多種脂蛋白的待測物中的殘粒樣脂蛋白膽甾醇的定量方法含有下述步驟：(1)將殘粒樣脂蛋白以外的脂蛋白中的膽甾醇除去的步驟；與(2)對殘留的殘粒樣脂蛋白中的膽甾醇進行定量的步驟。在步驟(1)中，使分子量超過40kDa且不具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶作用，在步驟(2)中，使分子量為40kDa以下的膽甾醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶作用。

【技術實現步驟摘要】
本申請是2011年11月9日提交的題為“殘粒樣脂蛋白膽甾醇的定量方法及用于其的試劑盒”的PCT/JP2011/075837號專利技術專利申請的分案申請，原申請進入中國國家階段獲得的國家申請號為201180054103.0。
本專利技術涉及殘粒樣脂蛋白(RLP)中的膽甾醇的定量方法及用于其的試劑盒。
技術介紹
血液中所含的脂蛋白利用超速離心分離根據密度的不同而可分為乳糜微粒、超低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。已知這些脂蛋白的甘油三酯、膽甾醇等脂質或蛋白等的含量不同，各自在生物體內表現出不同的作用。RLP是乳糜微粒、VLDL等甘油三酯含量多的脂蛋白的中間代謝產物，通常會被迅速代謝而從血液中消失，但代謝中產生任何異常時則會停留、蓄積于血液中。RLP容易沉積于動脈壁，被認為是動脈硬化引發性的脂蛋白之一。作為RLP中的膽甾醇的定量方法，已知有利用含有抗ApoA-I單克隆抗體和抗ApoB-100單克隆抗體的親和膠，將RLP從血清中分離，對分離的RLP中所含的膽甾醇進行測定的方法，用于該方法的試劑已有市售。另一方面，近來作為不需要分離操作的RLP膽甾醇的定量方法，報道有使膽甾醇酯酶、膽甾醇氧化酶或膽甾醇脫氫酶、以及磷脂酶與待測物試樣作用的方法（專利文獻1）。另外也報道有使用2種表面活性劑的方法（專利文獻2）、使用脂蛋白脂肪酶活性和膽甾醇酯酶活性的比率為12～7000的膽甾醇酯酶的方法（專利文獻3）、使用具有苯磺酸結構的表面活性劑或聚丙烯酸系表面活性劑的方法（專利文獻4）。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：日本專利4456715號公報專利文獻2：WO2007/066760號公報專利文獻3：WO2006/057377號公報專利文獻4：WO2007/083523號公報。
技術實現思路
專利技術要解決的技術問題本專利技術的目的在于提供用于不需要分離操作而簡便、且準確地定量待測物試樣中的RLP膽甾醇的方法和用于該方法的試劑盒。用于解決技術問題的手段本申請專利技術人發現：在酶法測定含有各種脂蛋白的被測物試樣的膽甾醇時，若使分子量超過40kDa且不具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶作用，則RLP以外的脂蛋白會發生反應，若使分子量為40kDa以下的膽甾醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶作用，則包括RLP的所有脂蛋白均會發生反應。于是，通過利用該見解，想到了不需進行分離操作，即可簡便地對RLP中的膽甾醇進行定量的方法，從而完成了本專利技術。即，本專利技術如下所述：[1]含有包含殘粒樣脂蛋白的多種脂蛋白的待測物中的殘粒樣脂蛋白膽甾醇的定量方法，該方法含有：(1)將殘粒樣脂蛋白以外的脂蛋白中的膽甾醇除去的步驟，和(2)對殘留的殘粒樣脂蛋白中的膽甾醇進行定量的步驟；在前述步驟(1)中，使分子量超過40kDa且不具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶作用，在前述步驟(2)中使分子量為40kDa以下的膽甾醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶作用。[2][1]所述的方法，其中，前述步驟(1)含有使前述膽甾醇酯酶與膽甾醇氧化酶作用，并將生成的過氧化氫除去的步驟；前述步驟(2)含有使前述膽甾醇酯酶與膽甾醇氧化酶作用，并對生成的過氧化氫進行定量的步驟。[3][1]或[2]所述的方法，其中，前述步驟(1)和前述步驟(2)是在非離子系表面活性劑的存在下進行。[4][1]～[3]中任一項所述的方法，其中，前述步驟(1)和前述步驟(2)中所用的前述非離子系表面活性劑是選自HLB值為11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧化烯烷基醚和聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少1種。[5][1]～[4]中任一項所述的方法，其中，在前述步驟(1)中，進一步使磷脂酶作用。[6]殘粒樣脂蛋白膽甾醇定量用試劑盒，其至少含有以下2種試劑組合物：(i)含有分子量超過40kDa且不具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶來作為膽甾醇酯酶的、用于將被測物試樣中的殘粒樣脂蛋白以外的脂蛋白中的膽甾醇除去并引導至反應體系外的試劑組合物；(ii)含有分子量為40kDa以下的膽甾醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶來作為膽甾醇酯酶的、用于對殘粒樣脂蛋白膽甾醇進行定量的試劑組合物。[7][6]所述的試劑盒，其中，至少前述(i)的試劑組合物含有膽甾醇氧化酶。[8][6]或[7]所述的試劑盒，其中，前述(i)和(ii)的試劑組合物至少含有選自HLB值為11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少1種非離子表面活性劑。[6]～[8]中任一項所述的試劑盒，其中，前述(i)的試劑組合物進一步含有磷脂酶。專利技術效果根據本專利技術，提供可不需分離操作而簡便、且準確地定量待測物試樣中的RLP膽甾醇的新方法和用于該方法的試劑盒。附圖說明[圖1]是示出利用下述實施例1中記載的本專利技術的方法而得的RLP中膽甾醇的定量結果、與利用使用抗RLP單克隆抗體的公知方法而得的定量結果的相關關系的圖。[圖2]是示出利用下述實施例2中記載的本專利技術的方法而得的RLP中膽甾醇的定量結果、與利用使用抗RLP單克隆抗體的公知方法而得的定量結果的相關關系的圖。[圖3]是示出利用下述實施例3中記載的本專利技術的方法而得的RLP中膽甾醇的定量結果、與利用使用抗RLP單克隆抗體的公知方法而得的定量結果的相關關系的圖。[圖4]是示出利用下述實施例4中記載的本專利技術的方法而得的RLP中膽甾醇的定量結果、與利用使用抗RLP單克隆抗體的公知方法而得的定量結果的相關關系的圖。[圖5]是示出利用下述實施例5中記載的本專利技術的方法而得的RLP中膽甾醇的定量結果、與利用使用抗RLP單克隆抗體的公知方法而得的定量結果的相關關系的圖。[圖6]是示出利用下述實施例6中記載的本專利技術的方法而得的RLP中膽甾醇的定量結果、與利用使用抗RLP單克隆抗體的公知方法而得的定量結果的相關關系的圖。[圖7]是示出利用下述實施例7中記載的本專利技術的方法而得的RLP中膽甾醇的定量結果、與利用使用抗RLP單克隆抗體的公知方法而得的定量結果的相關關系的圖。具體實施方式作為脂蛋白中所含的膽甾醇，有酯型膽甾醇（膽甾醇酯）和游離型膽甾醇。本專利技術中，簡稱為“膽甾醇”的情形包含上述兩者。本專利技術的方法中要定量的RLP意指合并了乳糜微粒殘粒與VLDL殘粒的脂蛋白。供于本專利技術的方法的待測物只要含有包含殘粒樣脂蛋白的多種脂蛋白則沒有特別限定，通常為血液（包含全血、血清和血漿）等體液或其稀釋物。本專利技術中的步驟(1)中，將RLP以外的脂蛋白中的膽甾醇選擇性地除去。這里，“除去”意指分解膽甾醇、并且使其分解物在后續的步驟(2)中不被檢測出。作為將RLP以外的脂蛋白中所含的膽甾醇選擇性地除去的方法，可舉出例本文檔來自技高網...

【技術保護點】
含有包含殘粒樣脂蛋白的多種脂蛋白的待測物中的殘粒樣脂蛋白膽甾醇的定量方法，該方法含有：(1)　將殘粒樣脂蛋白以外的脂蛋白中的膽甾醇除去的步驟，和(2)　對殘留的殘粒樣脂蛋白中的膽甾醇進行定量的步驟；在前述步驟(1)中，使分子量超過40kDa且不具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶作用，在前述步驟(2)中使分子量為40kDa以下的膽甾醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶作用。

【技術特征摘要】
2010.11.10 JP 2010-2515111.含有包含殘粒樣脂蛋白的多種脂蛋白的待測物中的殘粒樣脂蛋白膽甾醇的定量方法，該方法含有：
(1)將殘粒樣脂蛋白以外的脂蛋白中的膽甾醇除去的步驟，和
(2)對殘留的殘粒樣脂蛋白中的膽甾醇進行定量的步驟；
在前述步驟(1)中，使分子量超過40kDa且不具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶作用，在前述步驟(2)中使分子量為40kDa以下的膽甾醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亞基的膽甾醇酯酶作用。
2.權利要求1所述的方法，其中，前述步驟(1)含有使前述膽甾...

【專利技術屬性】
技術研發人員：平尾裕子，
申請(專利權)人：電化生研株式會社，
類型：發明
國別省市：日本;JP