本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種通過將細(xì)菌的nif(固氮)基因定向到植物質(zhì)體或在植物質(zhì)體中表達(dá)，來工程化復(fù)制光合細(xì)菌例如藍(lán)細(xì)菌或其他細(xì)菌的固氮機(jī)制的轉(zhuǎn)基因植物的方法。提供了一種使用復(fù)制光合細(xì)菌的固氮機(jī)制的植物來降低土壤中的總氮濃度的方法。還提供了復(fù)制光合細(xì)菌的固氮機(jī)制的植物的后代。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】【專利說明】 與相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求2013年7月25日提交的美國臨時申請?zhí)?1/858, 218和2012年12 月3日提交的美國臨時申請?zhí)?1/732, 490的優(yōu)先權(quán)，所述每個臨時申請以其全部內(nèi)容通過 參考并入本文。
本公開涉及一種新的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物通過靶向或表達(dá)細(xì)菌的 nif(固氮）基因以產(chǎn)生固氮酶的結(jié)構(gòu)蛋白，并通過導(dǎo)入編碼與固氮酶的結(jié)構(gòu)蛋白同源的蛋 白質(zhì)的合成DNA序列，來復(fù)制光合細(xì)菌例如藍(lán)細(xì)菌或其他細(xì)菌的固氮機(jī)制，還涉及產(chǎn)生這 樣的植物的方法。
技術(shù)介紹
植物是屬于植物界的活生物體。所有高等植物具有維管組織木質(zhì)部（主要運(yùn)輸水 和礦物質(zhì)）和韌皮部（主要運(yùn)輸糖類和其他代謝物）。維管植物包括所有具種子的植物（裸 子植物和被子植物）和蕨類植物（包括羊齒類植物、石松類植物和木賊類植物），其也被稱 為導(dǎo)管植物。它們是具有有組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真核生物，所述細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括核（在大多數(shù) 細(xì)胞中）和具有在光合作用期間使用光例如日光作為能源進(jìn)行碳固定的能力的葉綠體（或 其他類型的質(zhì)體）。其他類型的植物包括例如藻類、苔蘚和真菌。 農(nóng)業(yè)作物的作物生產(chǎn)率的總體限制因素是土壤和水中的氮含量。隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)試 圖與增長的人口的不斷增加的需求和減少的可用耕地保持同步，這種元素的供應(yīng)隨時間減 少。氮是所有生命形式、包括植物必需的重要營養(yǎng)物之一。然而，氮必須首先被轉(zhuǎn)變成植物 可以利用的形式。生物固氮（BNF)現(xiàn)象是使用固氮酶將大氣中的氮（N2)轉(zhuǎn)變成氨（NH3)。 BNF通常由下列化學(xué)反應(yīng)式表示：N2+8H++8ell6ATP?>2NH3+H2+16ADP+16Pi，或者說在8個 質(zhì)子和8個電子存在下并消耗16個ATP分子（三磷酸腺苷一一細(xì)胞的能量分子），將氮?dú)?分子還原成兩個氨分子。由于隊含有叁鍵，這個反應(yīng)消耗大量能量。氮?dú)夥肿又械逆I能約 為225kcal/mol。在自然界中，很少有BNF作為構(gòu)成"固氮酶復(fù)合體"的植物與幾個細(xì)菌物 種之間的共生關(guān)系的結(jié)果而進(jìn)行。固氮酶復(fù)合體由兩種蛋白構(gòu)成：Fe蛋白（被稱為Nif-H 的酶）和Mo-Fe蛋白（被稱為Nif-D-K的a和0亞基）。固氮酶復(fù)合體由與同二聚體 (至少兩個相同單元）的Fe(鐵輔因子）蛋白暫時結(jié)合的異四聚體（不是相同單元）的 MoFe(鐵-鉬輔因子）蛋白構(gòu)成。Nif-H基因編碼鐵蛋白，Nif-D和K基因編碼鉬鐵蛋白。因此，Nif-D和Nif-K基 因在它們的最終活性形式中需要Mo和Fe作為輔因子。Nif-D編碼Nif-D蛋白，也被稱為 a亞基，Nif-K編碼Nif-K的蛋白被稱為0亞基。換句話說，Nif-H是具有兩個相同亞基 的二聚體酶（總共2個蛋白），而Nif-D-K是2a20二聚體（總共4個蛋白）。所有6個 亞基對于其功能來說是必需和必要的。在自然界中，Nif-H具有大量變種，并對生物多樣性 有貢獻(xiàn)。存在大量類型的Nif-H這一事實(shí)，提供了適應(yīng)各種不同自然條件的能力。 產(chǎn)生固氮酶復(fù)合體的細(xì)菌物種包括固氮生物例如藍(lán)細(xì)菌、固氮菌科 (azotobacteraceae)、根瘤菌（rhizobia)和弗蘭克氏菌（frankia)。例如，在藍(lán)細(xì)菌中， Mo-Fe蛋白（Nif-D-K)結(jié)合大氣中的氮（N2)，然后Fe-蛋白（Nif-H)通過由鐵氧化還原蛋白 貢獻(xiàn)的電子將它還原。鐵氧化還原蛋白是在光合作用電子傳遞鏈中起到電子載體作用的蛋 白質(zhì)，其類似于高等植物葉綠體的Fe2S2鐵氧化還原蛋白，但不完全一致。被還原的Fe-蛋 白使用ATP將（被還原的）電子傳遞到Mo-Fe蛋白，后者然后將電子貢獻(xiàn)給N2 (固氮酶還 原酶）。通過將這個過程重復(fù)幾次，將N^N的所有三個共價鍵還原成2NH3。 然而，僅有幾種植物物種可以與固氮生物以共生關(guān)系生活。例如，來自于豆科植物 的豌豆植物與來自于根瘤菌科的細(xì)菌共生生活。具體來說，根瘤菌細(xì)菌穿透豌豆植物的根， 產(chǎn)生含有固定氮（成為氨）的細(xì)菌的根瘤，而植物貢獻(xiàn)碳（糖）。因此，改進(jìn)共生或擴(kuò)展宿 主范圍對于植物存活來說是有益的，但實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)包括許多挑戰(zhàn)，包括過程的復(fù)雜性和 基礎(chǔ)知識的欠缺。 也可以使用人工方法將氮化學(xué)固定。這種固氮方法最通常通過被稱為Harber過 程的熱反應(yīng)來生產(chǎn)。這個過程對于相對簡單的反應(yīng)來說需要高的壓力和溫度。最近一百年 來，對氮肥的需求穩(wěn)定地增長到每年超過2億公噸。這種消耗量可能增加。 非共生生物（例如與任何固氮微生物沒有確立的共生關(guān)系的自由生活的生物）， 如果各自包含核心酶固氮酶，可以實(shí)現(xiàn)自生物固氮（SBNF)。能夠自固氮的非細(xì)菌生物例如 作物和藻類以及其他植物的存在，對于幾種目的來說是有用的，例如降低施肥需求，降低施 肥污染，提供經(jīng)濟(jì)友好的作物生產(chǎn)，提高作物產(chǎn)量，提高植物中的油含量，提高植物中的蛋 白質(zhì)含量，降低水的氮污染，以及相對于氮提高碳含量和相對于土壤的有機(jī)相提高碳。然 而，出于幾個原因，沒有已知的能夠?qū)崿F(xiàn)這些結(jié)果的植物，其中一個原因是固氮酶的特殊酶 復(fù)合體，其包括幾種用于固氮的蛋白質(zhì)和基因。 用于大氣氮固定的幾乎所有的核心酶都對氧非常敏感。這一特征使得幾乎不可能 在植物中固氮，因?yàn)橹参镌诠夂献饔梅磻?yīng)期間從水產(chǎn)生氧。藍(lán)細(xì)菌被認(rèn)為是葉綠體的進(jìn)化 祖先（基礎(chǔ)）。盡管葉綠體在進(jìn)化期間已失去許多其原始的基因，但藍(lán)細(xì)菌維持了許多葉 綠體丟失的基因。作為光合生物，藍(lán)細(xì)菌棲息在地球上幾乎所有光照環(huán)境中。它們在由超 過20個固氮（NIF)基因促進(jìn)的生物固氮（BNF)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些基因中只有三 個（Nif-D、Nif-K和Nif-H)是NIF酶類（固氮酶）。其余的NIF基因參與復(fù)合體組裝、輔 因子加工和表達(dá)的控制。 豆科作物例如大豆、菜豆或豌豆以它們發(fā)育出被根瘤菌（Rhizobiumsp.)共生細(xì) 菌占據(jù)的根瘤的獨(dú)特能力廣為人知。這些細(xì)菌能夠BNF并向植物提供氨。大多數(shù)作物不具 有這種能力，并且根瘤菌（Rhizobiumsp.)不能與它們相互作用。進(jìn)行了幾次未發(fā)表的嘗 試以擴(kuò)展根瘤菌的"宿主"范圍，但所有這些嘗試都失敗了。 因此，需要一種系統(tǒng)和方法，其包含能夠以使系統(tǒng)可持續(xù)并且在商業(yè)上可行的顯 著速率進(jìn)行細(xì)胞固氮以生產(chǎn)氨的轉(zhuǎn)基因植物。下面的部分描述這樣的系統(tǒng)。 專利技術(shù)概述 本公開涉及被轉(zhuǎn)化以便能夠進(jìn)行自行/自我固氮過程，產(chǎn)生它們自己可用的氮 源，由此降低對作為氮源的含氮肥料的依賴性的轉(zhuǎn)基因植物（遺傳修飾生物體或（GM0))。 本公開還涉及包含轉(zhuǎn)化這些植物以使它們能夠進(jìn)行自行/自身固氮的基因的植物細(xì)胞、組 織、植物部分或植物株系。 在某些實(shí)施方式中，根據(jù)本公開的原理，提供了一種表現(xiàn)出改良的自身/自行固 氮情況的植物，其通過包括下列步驟的方法來產(chǎn)生：將編碼可操作連接到啟動子序列和終 止子序列的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重組核酸序列導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞；從所述 植物細(xì)胞再生一株或多株植物，并選擇從所述植物細(xì)胞培養(yǎng)并表現(xiàn)出增強(qiáng)的固氮的一株或 多株植物，使得一株或多株植物包含編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重組核酸序列。 在某些實(shí)施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重組核酸序列從單一生物體獲 得。在某些實(shí)施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和N本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種表現(xiàn)出增強(qiáng)的固氮的轉(zhuǎn)基因植物，其通過包含下列步驟的方法來產(chǎn)生：將一個或多個植物細(xì)胞與編碼可操作連接到啟動子序列和終止子序列的Nif?H、Nif?D和Nif?K基因的重組核酸序列相接觸；從所述植物細(xì)胞再生一株或多株植物；以及選擇從所述植物細(xì)胞培養(yǎng)的、表現(xiàn)出增強(qiáng)的固氮的一株或多株植物，其中所述一株或多株植物包含編碼Nif?H、Nif?D和Nif?K基因的所述重組核酸序列。
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：阿迪·查爾茲曼，
申請(專利權(quán))人：阿迪·查爾茲曼，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。