一種基于原位形成光活性納米材料模擬酶的堿性磷酸酯酶活性檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種基于光活性納米材料模擬酶且具有高效信號(hào)放大作用的堿性磷酸酯酶活性檢測(cè)方法。堿性磷酸酶(ALP)的水解產(chǎn)物鄰苯二酚或水楊酸能夠特異性的結(jié)合在TiO2納米材料表面，形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物，從而使TiO2納米材料在可見(jiàn)光照射下表現(xiàn)出高效的模擬酶活性。區(qū)別于傳統(tǒng)的納米材料模擬酶，該光活性模擬酶通過(guò)天然酶的催化反應(yīng)原位產(chǎn)生，并且其在工作時(shí)不需要使用高濃度的H2O2，具有良好的生物相容性。本發(fā)明專利技術(shù)通過(guò)堿性磷酸酶的催化反應(yīng)原位產(chǎn)生的光活性納米模擬酶對(duì)堿性磷酸酶的活性檢測(cè)產(chǎn)生高效的信號(hào)放大作用，使得檢測(cè)ALP活性的檢測(cè)限可達(dá)0.01U/L。該新型方法具有簡(jiǎn)便、靈敏、快速的優(yōu)點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【專利說(shuō)明】活性檢測(cè)方法
:本專利技術(shù)涉及納米科技領(lǐng)域和生物分析檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及新型的光活性納米材料模擬酶及其在堿性磷酸酯酶活性檢測(cè)中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
:堿性磷酸酯酶(ALP)是廣泛存在于各種生物組織中的一種酶。ALP的存在濃度與骨骼疾病、肝炎以及前列腺癌等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。此外，ALP具有催化活性高，穩(wěn)定性好，成本低，廣泛的底物特異性等優(yōu)點(diǎn)，是一種被廣泛使用的免疫分析標(biāo)記物，被用于酶聯(lián)免疫測(cè)定中。在酶聯(lián)免疫測(cè)定中，抗原與抗體之間可以產(chǎn)生特異性的結(jié)合，通過(guò)標(biāo)記在抗體上的ALP的催化反應(yīng)產(chǎn)生測(cè)量信號(hào)。因?yàn)閱蝹€(gè)酶分子可以催化許多個(gè)底物分子產(chǎn)生大量的產(chǎn)物，從而使檢測(cè)信號(hào)放大。目前，以天然酶為標(biāo)記物的酶聯(lián)免疫吸附分析在環(huán)境檢測(cè)、食品安全及臨床診斷等方面已經(jīng)成長(zhǎng)為重要的技術(shù)之一 。因此，ALP活性的檢測(cè)在臨床疾病診斷以及免疫分析研宄中具有重要意義。目前，大部分針對(duì)ALP的檢測(cè)方法雖然較為簡(jiǎn)單，但是，由于這類方法單純依靠ALP催化產(chǎn)生的產(chǎn)物的電化學(xué)信號(hào)或光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，缺少信號(hào)放大策略，方法的靈敏度不是很高。所以，探索高效的信號(hào)放大策略以建立高靈敏的ALP活性的檢測(cè)方法仍然是需要解決的問(wèn)題。隨著納米科技的發(fā)展，基于納米材料的分析方法因其具有快速、靈敏的特點(diǎn)以及更加容易微型化等優(yōu)點(diǎn)引起了大家廣泛的關(guān)注。納米材料模擬酶具有高效的模擬酶活性，并且還具有穩(wěn)定性好，酶活性容易調(diào)節(jié)等特點(diǎn)。盡管具有過(guò)氧化物酶活性的納米材料具有較好的活性，但缺乏方便的手段控制和觸發(fā)其類酶活性。另外，此類酶在工作時(shí)依賴具有危害性的過(guò)氧化氫作為電子受體。這些問(wèn)題嚴(yán)重限制著過(guò)氧化物納米材料模擬酶的活性、生物相容性及其在生物分析中的應(yīng)用。目前的納米材料模擬酶幾乎都是采用一定的化學(xué)試劑反應(yīng)制備好后使用。與當(dāng)前的研宄不同，本專利技術(shù)利用天然酶酶的催化反應(yīng)原位形成了一種具有較高催化活性的光活性納米材料模擬酶。堿性磷酸酯酶(ALP)催化磷酸酯類底物如鄰苯二酚磷酸酯、水楊酸磷酸酯的水解反應(yīng)產(chǎn)生的含有雙羥基的化合物能夠與二氧化鈦納米材料表面的鈦(IV)發(fā)生特異性的絡(luò)合反應(yīng)，在納米材料表面形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。單獨(dú)的二氧化鈦納米材料并沒(méi)有表現(xiàn)出光活性模擬酶性質(zhì)，而結(jié)合了雙羥基化合物的二氧化鈦納米材料可以在可見(jiàn)光光照條件下產(chǎn)生較高的模擬氧化酶活性。該氧化酶的活性可以通過(guò)光照方便的進(jìn)行調(diào)控；在不依靠過(guò)氧化氫的存在下，表現(xiàn)出了很高的類酶催化活性，表明其具有更好的穩(wěn)定性和生物相容性。與大多數(shù)納米材料模擬酶相比，本方法的特點(diǎn)在于此納米光活性模擬酶通過(guò)ALP的原位催化反應(yīng)產(chǎn)生；與常規(guī)的ALP活性檢測(cè)方法相比(單純依靠催化反應(yīng)的產(chǎn)物的電化學(xué)/光學(xué)信號(hào))，ALP的催化產(chǎn)物原位形成的納米光活性模擬酶進(jìn)一步對(duì)ALP活性的檢測(cè)產(chǎn)生了良好的信號(hào)放大作用。實(shí)現(xiàn)了 ALP活性的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限低至0.01U/L，遠(yuǎn)低于成人血清中 ALP 的含量 40-190U/L。滿足實(shí)際樣品中ALP的檢測(cè)需求。據(jù)我們所知，利用酶催化反應(yīng)原位形成的光活性納米材料模擬酶進(jìn)行酶活性檢測(cè)，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。該方法在ALP的檢測(cè)以及以ALP為標(biāo)記物的免疫分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
:本專利技術(shù)的目的是提供一種基于光活性納米材料模擬酶的堿性磷酸酯酶活性檢測(cè)方法，該光活性納米材料模擬酶可以通過(guò)堿性磷酸酯酶的催化反應(yīng)原位產(chǎn)生；利用堿性磷酸酯酶催化反應(yīng)形成的光活性納米材料模擬酶的高效類酶催化活性實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，可以方便、靈敏、快速地檢測(cè)堿性磷酸酯酶活性。本專利技術(shù)的目的可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn):a、二氧化鈦納米材料的制備:將5mL含鈦化合物逐滴加入到75mL超純水中，混合后的溶液在室溫下持續(xù)攪拌。然后將上述溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜內(nèi)并加熱到160°C持續(xù)24h。離心獲得產(chǎn)物并用超純水洗滌多次，最后烘干獲得白色二氧化鈦納米顆粒；b、堿性磷酸酶活性的測(cè)定:5 μ mo I/L的堿性磷酸酶的底物與10 μ L不同濃度的堿性磷酸酯酶混合后加入到96微孔板中，室溫下反應(yīng)一段時(shí)間；加入10 μ L 1.5mg/mL的二氧化鈦納米材料反應(yīng)15min后，加入100 μ L pH為4.0的0.2mol/L的醋酸緩沖溶液和20 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種基于原位形成光活性納米材料模擬酶的堿性磷酸酯酶活性檢測(cè)方法，其特征在于：a、二氧化鈦納米材料的制備：將5mL含鈦化合物逐滴加入到75mL超純水中，混合后的溶液在室溫下持續(xù)攪拌。然后將上述溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜內(nèi)并加熱到160℃持續(xù)24h。離心獲得產(chǎn)物并用超純水洗滌多次，最后烘干獲得白色二氧化鈦納米顆粒；b、堿性磷酸酯酶活性的測(cè)定：5μmol/L的堿性磷酸酯酶的底物與10μL不同濃度的堿性磷酸酯酶混合后加入到96孔板中，室溫下反應(yīng)一段時(shí)間；加入10μL?1.5mg/mL的二氧化鈦納米材料反應(yīng)15min后，加入100μL?pH為4.0的0.2mol/L的醋酸緩沖溶液和20μL?5mmol/L的納米材料模擬酶的特征底物，放置在氙燈下用可見(jiàn)光(λ≥400nm)照射10min后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸收光譜或者熒光光譜。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王光麗，金璐怡，吳秀明，曹根霞，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：江蘇;32