本發明專利技術公開了一種含三唑結構鏈接子的新型組合抗菌肽及其制備方法，屬于生化技術領域。本發明專利技術以含炔丙基甘氨酸和疊氮基賴氨酸的前體肽為底物，CuSO4.5H2O為催化劑，抗壞血酸鈉為抗氧化劑，水-叔丁醇為混合溶劑，采用點擊化學的1,3-偶極環加成反應24~28小時，產生一個1,4-二取代-1H-1,2,3-三唑結構，將上述前體肽鏈接而得。通過對常見的標準菌以及臨床分離的耐藥菌的抗菌實驗，表明本發明專利技術合成的J-AR肽和J-RR肽具有較強的抗菌活性、抗耐藥菌活性，同時掃描電鏡實驗觀察側鏈鏈接組合抗菌肽可以引起大腸桿菌菌膜的破壞。因此，本發明專利技術公開的含三唑結構鏈接子的新型組合抗菌肽在制備臨床治療藥物方面具有很好的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物化學
，涉及一種具有很好的抗耐藥菌活性的組合抗菌 肽，尤其涉及一種具有抗耐藥性的含三唑結構鏈接子的組合抗菌肽及其制備合成方法。
技術介紹
近年來，濫用抗生素產生的耐藥性問題日益嚴重，對人類疾病造成了巨大的威脅。 尋找新的可替代抗生素的新藥迫在眉睫。抗菌肽（Antimicrobial peptides)，是生物體 經誘導產生的一類具有抗菌活性的小分子多肽，來源廣泛，其分子量小，大約在3~6 kD之 間，有耐熱、耐酸性強，水溶性好，快速的殺菌能力等特點（Hancock REW，Scott MG. Proc Natl AcadSci USA，2000,97 (16):8856~ 8861)。抗菌肽的抗菌機制不同于普通抗生素，抗 菌機制一般包括①快速破壞菌膜，使菌體內容物泄露，細菌死亡②抗菌肽與細菌細胞內容 物(如DNA或RNA)作用，干擾細菌細胞正常的合成和代謝，導致菌體死亡(劉立偉，鄧磊.抗 菌肽作用機制研宄進展.河北化工，2012, 35 (7) :13-15)。所以，抗菌肽不易誘導耐藥 性的產生，使其成為生物醫藥領域的熱門研宄內容。但是，部分天然抗菌肽也存在抗菌活性 弱，對耐藥菌作用無效等缺點，將限制抗菌肽的發展。 點擊化學主要用于研發和制造可用于醫學診斷和新藥開發的新型生化標記 物。目前，它被認為是一項非常理想的技術，已經被應用于藥物開發。點擊化學的代表 是Cu催化的疊氮基和炔基的1，3-偶極環加成反應。產物有1，4-二取代-1，2, 3-三唑 結構，其中1，4-二取代-1，2, 3-三唑結構被認為是一種新型的藥效團，有極大地潛力可 以將其運用到抗癌，抗菌，HIV酶抑制劑等研宄中（Agalave SG, Maujan SR, Pore VS，ei al. Click chemistry: I, 2, 3-triazoles as pharmacophores . Chem Asian J, 2011, 6(10) :2696-2718.)。有報道將抗菌肽以點擊化學的方法進行側鏈連接有助于提高抗菌 肽對細胞膜的穿透能力（Christopher J.etal, Enhanced Membrane Pore Formation by Multimeric/Oligomeric Antimicrobial Peptides,Biochemistry 2007, 46, 13437-13442)。因此，我們采用點擊化學的方法，用1，2, 3-三唑結構作為鏈接子，側鏈鏈接 抗菌肽，合成出抗菌活性增強的新型組合抗菌肽，以期具有良好的抗耐藥菌活性，擴寬抗菌 譜的應用。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種具有新型結構的含三唑結構鏈接子的組合抗菌肽； 本專利技術的另一目的是提供一種上述含三唑結構鏈接子的組合抗菌肽的合成方法。 -、具有抗耐藥性的含三唑結構鏈接子的組合抗菌肽 本專利技術具有抗耐藥性的組合抗菌肽的結構式如下所示：二、具有抗耐藥性的含三唑結構鏈接子的組合抗菌肽的制備 本專利技術具有抗耐藥性的含三唑結構鏈接子的組合抗菌肽的制備方法，是以含炔丙基甘 氨酸和疊氮基賴氨酸的前體肽為底物，以CuSO4. 5H20為催化劑，以抗壞血酸鈉為抗氧化劑， 以水-叔丁醇為混合溶劑，采用點擊化學的1，3-偶極環加成反應24~28小時，產生一個 1，4-二取代-1片1，2, 3-三唑結構將上述前體肽鏈接而得。 所述含炔丙基甘氨酸的前體肽序列為AC-Pra-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Th 1-1^11-1^11-順2或 AC-Pra-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-NH2;含塊丙基甘氨酸（Pra)和含疊氮 基賴氨酸的前體肽的摩爾比為2。 催化劑CuSO4. 5H20的用量為疊氮基賴氨酸的前體肽摩爾量的5~10倍。 抗氧化劑抗壞血酸鈉的用量為疊氮基賴氨酸的前體肽摩爾量的15~25倍。 混合溶劑水-叔丁醇中，水與叔丁醇的體積比為1:0. 1~1:10。 上述反應式如下： 圖1、2分別為上述方法合成的含三唑結構鏈接子的組合抗菌肽J-AR、J-RR的質譜圖。 J-AR和J-RR的分子量等于它們各自前體肽分子量之和，經計算為J-AR的分子量為2492， J-RR的分子量為2342,從圖1、2可以看出，J-AR和J-RR的分子量和我們理論計算的結果 一致，證明我們合成的產物與我們設計的抗菌肽結構一致。 三、目標肽J-AR和J-RR的體外抑菌實驗 1.對標準菌株的抑菌實驗 采用常見的二倍稀釋法測定藥物的最小抑菌濃度，即MIC值。結果重復三次以上的、平 行實驗。結果見表1。 2.對耐藥菌株的最低抑菌濃度 采用常見的二倍稀釋法測定藥物的最小抑菌濃度，即MIC值。結果重復三次以上的、平 行實驗。結果見表2。 表1、2的結果表明，新型組合抗菌肽J-AR和J-RR抗菌活性顯著提高，同時產生良 好的對抗耐藥菌的活性，對臨床分離的耐藥菌株均不產生耐藥性。臨床上常見的抗生素作 用耐藥菌均出現耐藥性，對其不產生抗菌作用。 3.組合抗菌肽J-AR、J-RR的掃描電鏡試驗 該方法可以從形態學上直觀的觀察抗菌肽作用于細菌后其對細菌細胞膜的作用效果。 圖1為大腸桿菌掃描電鏡：A) Anoplin組、B) RW組、C) J-AR組、D) J-RR組、E)陰性對照 組(大腸桿菌)。圖3的結果顯示，組合鏈接后并不改變母肽原有的破膜機制，當其與菌作用 時，造成菌膜形態發生變形凹陷，細菌內容泄露，菌體死亡。 綜上所述，經過生物活性篩選結果顯示，本專利技術合成的目標物組合抗菌肽J-AR、 J-RR具有很強的抗菌活性，對測試的標準的菌株具有很強的抗菌活性，而且對臨床分離的 耐藥菌株也有強的抗菌活性。同時掃描電鏡實驗觀察側鏈鏈接組合抗菌肽可以引起大腸桿 菌菌膜的破壞。因此，含三唑鏈接子的新型組合抗菌肽具有優良的應用前景。【附圖說明】 圖1為J-AR的質譜圖。 圖2為J-RR的質譜圖。 圖3為不同抗菌肽的掃描電鏡圖。【具體實施方式】[0當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
具有抗耐藥性的含三唑結構鏈接子的組合抗菌肽，其結構式如下所示：或。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：倪京滿，王銳，劉倍均，
申請(專利權)人：蘭州大學，
類型：發明
國別省市：甘肅;62
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