類芽孢桿菌CGMCC No.8333凝乳酶及制備方法技術

本發明專利技術公開了一種類芽孢桿菌(Paenibacillus?damxungensis?sp.nov.)CGMCC?No.8333的凝乳酶及制備方法。所述的方法包括以下的步驟：(1)將保藏編號為CGMCC?No.8333的發酵液離心得發酵上清液；(2)將發酵上清液與硫酸銨混合，至發酵液中硫酸銨的飽和度為50～75％，得混合液，2～6℃靜置混合液0～5小時，離心收集沉淀物；(3)將沉淀物溶解，離心，取上清液即得。所述的方法大幅簡化了凝乳酶的制備工藝步驟；并且與使用乙醇提取凝乳酶相比，大大節約了生產成本，操作簡便有效，安全可靠，有利于應用于工業化生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體涉及一種類芽孢桿菌CGMCC No. 8333凝乳酶及制 備方法。
技術介紹
與植物來源和動物來源的凝乳酶相比較，微生物來源的凝乳酶具有生產成本低、 生化多樣性高、基因易改造的優勢。目前，越來越多的報道說明微生物的胞外蛋白酶具有凝 乳功能，部分微生物的凝乳酶已實現大規模工業化生產，并廣泛應用于干酪生產中。能夠產 生具有一定凝乳作用的胞外蛋白酶的微生物主要屬于放線菌、細菌和霉菌等的范疇，包括 放線菌中的鏈霉菌屬、小單孢菌屬、馬杜拉放線菌屬，霉菌中根霉、總狀毛霉、微小毛霉、米 黑毛霉、易脆毛霉，細菌中粟疫菌、寄生內座殼菌以及其他通過基因工程或輻照獲得的高產 凝乳酶的菌株等。 將凝乳酶從發酵上清中分離出來并實現凝乳酶的高效回收是分離純化、酶學性質 研宄以及工業化生產凝乳酶的前提和基礎。常用的分離方法有鹽析法、有機溶劑沉淀法 (乙醇、丙酮）以及等電點法，其中，鹽析、乙醇和丙酮沉淀應用最為廣泛。例如，有學者使 用1%氯化鈉溶液浸提微小毛霉發酵液中的凝乳酶，后用95%的乙醇對浸提物進行沉淀； 有學者使用乙醇按不同比例分步提取微小毛霉發酵液中的凝乳酶；還有學者以總狀毛霉 R132的發酵液為研宄對象，對其超濾后進行乙醇分步提取。另有其他學者利用丙酮、乙醇等 對栗疫菌、根霉、青霉、曲霉、枯草芽孢桿菌、粘球菌、糞腸球菌產凝乳酶進行初步分離提取。 中國專利申請（CN103740618A)公開了類芽孢桿菌屬的一個新菌種類芽孢桿 菌 BD3526，Paenibacillus damxungensis sp. ηον·，并將其于 2013 年 10 月 14 日保藏在 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，該菌株的保藏編號為：CGMCC No. 8333。該菌株的菌落非常粘稠，表明該菌株具有高產胞外多糖的生理特性。中國專利申 請（CN104450655A)公開了使用乙醇提取類芽孢桿菌BD3526麩皮發酵液上清中凝乳酶，但 是其操作工藝復雜，所得凝乳酶的回收率低，難以滿足大規模工業化生產的需要。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是，針對目前利用類芽孢桿菌麩皮發酵物制備凝乳酶 時，所得的發酵物粘稠難以將凝乳酶純化分離，所得的凝乳酶回收率低，難以滿足大規模工 業化生產的需要的不足，提供一種利用類芽孢桿菌麩皮發酵物制備凝乳酶的方法。所述的 方法達到了凝乳酶回收率高和粗酶樣品中多糖含量較低的良好效果。 本專利技術專利技術人發現，類芽孢桿菌CGMCC No. 8333具有高產凝乳酶的特性外，還具有 很強的胞外多糖的合成能力，發酵液中的多糖具有強的懸浮性能，不能實現凝乳酶和胞外 多糖的有效分離。利用乙醇沉淀時，凝乳酶回收率雖高，但混雜了很多的胞外多糖，溶解性 能差、黏度很高，限制了后期分離純化和酶學性質研宄，在工業化生產上也不具備可行性， 因此本專利技術人對類芽孢桿菌CGMCC No. 8333發酵液分離純化凝乳酶的工藝進行調整改進。 本專利技術提供一種利用類芽抱桿菌（Paenibacillus damxungensis sp. nov. )CGMCC No. 8333發酵液制備凝乳酶的方法，其包括以下的步驟： (1)將保藏編號為CGMCC No. 8333的類芽孢桿菌的發酵液離心得發酵上清液； (2)將步驟（1)所得發酵上清液與硫酸銨混合得混合液，所述混合液中硫酸銨的 飽和度為50~75%，2~6°C靜置混合液0~5h，離心收集沉淀物； ⑶將步驟⑵所得沉淀物溶解，離心，取上清液，即得凝乳酶。 步驟（1)為：將保藏編號為CGMCC No. 8333的類芽孢桿菌的發酵液離心得發酵上 清液。其中，較佳地，發酵液是由包括以下的步驟制備而得的：將保藏編號為CGMCC No. 8333 的類芽孢桿菌的種子液接種于麩皮培養基發酵培養得發酵液。所述的麩皮培養基為本領域 常規的麩皮培養基，其包括麩皮和水。所述的麩皮為本領域常規的麩皮，較佳地為小麥麩 皮。所述麩皮的含量為本領域常規的含量，較佳地為1 %~5 %，更佳地為2 %，所述百分比 為質量百分比。較佳地，所述發酵培養在錐形瓶中進行，更佳地在250mL錐形瓶中進行。所 述錐形瓶中所述的麩皮培養基的裝液量為本領域常規裝液量，更佳地為50mL。所述發酵培 養的時間為本領域常規的時間，較佳地為48~72小時。所述發酵培養的溫度為本領域常 規的溫度，較佳地為28~30°C。所述的種子液的接種量為本領域常規的接種量，較佳地為 2~4%，所述百分比為體積百分比。所述發酵培養的方式為本領域常規的方式，較佳地為 震蕩培養。所述震蕩培養的速度為本領域常規的速度，較佳地為180~300r/min。 較佳地，所述的種子液是由包括以下的步驟制備而得的：將保藏編號為CGMCC No. 8333的類芽孢桿菌接種于種子培養基種子培養得種子液。所述的種子培養基為本領域 常規的種子培養基，較佳地為TYC培養基。所述的TYC培養基為常規的TYC培養基，較佳的 由以下組分組成：酪蛋白胨或胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5. 0g/L，L-胱氨酸0. 2g/ L，乙酸鈉 20g/L，Na2SO4 0· lg/L，NaCl lg/L，Na2HPO4 · 12H20 2g/L，NaHCO3 2g/L，瓊脂 15 ~ 20g/L，余量為水。所述種子培養的時間為本領域常規的時間，較佳地為20小時。所述種子 培養的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為28~30°C。所述離心的時間為本領域常規的時 間，較佳地為15min。所述離心的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為4°C。所述離心的速 度為本領域常規的速度，較佳地為15000g。 步驟（2)為：將步驟（1)所得發酵上清液與硫酸銨混合得混合液，所述混合液中硫 酸銨的飽和度為50~75 %，2~6 °C靜置混合液0~5小時，離心收集沉淀物。其中，較佳 地，所述混合液中硫酸銨的飽和度為50~60%，更佳地為60%。所述靜置的時間為0~5 小時，較佳地為2小時。所述靜置的溫度為2~6°C，較佳地為2~4°C。所述離心的時間 為本領域常規的時間，較佳地為15分鐘。所述離心的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為 4°C。所述離心完成后，初步獲得了凝乳酶含量較高的粗提物。 _4] 步驟⑶為：將步驟⑵所得沉淀物溶解，離心，取上清液，即得凝乳酶。其中，所 述溶解的溶劑為本領域常規的溶劑，較佳地為水或PBS溶液。所述的PBS溶液為本領域常 規的PBS溶液，較佳地為0. 02mol/L、pH 7. 0的PBS溶液。所述離心的時間為本領域常規的 時間，較佳地為15分鐘。所述離心的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為4°C。所述離心的 速度為本領域常規的速度，較佳地為15000g。所述離心的步驟回收率殘留在凝乳酶中不溶 解的雜質，如菌體、培養基和其他的代謝產物等。較佳地，步驟（3)還包括將步驟（3)所述 上清液凍干的步驟。所述的凍干為本領域常規的凍干，能夠將上清液冷凍干燥即可。 本專利技術提供一種由上述的方法制備獲得的凝乳酶。 所述的凝乳酶具有較高的酶活性，凝乳酶活回收率高達21. 86%，適用于工業化應 用生產。 本專利技術所述的類芽孢桿菌CGMCC No. 8333從西藏本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用類芽孢桿菌(Paenibacillus?damxungensis?sp.nov.)CGMCC?No.8333的發酵液制備凝乳酶的方法，其特征在于，其包括以下的步驟：(1)將保藏編號為CGMCC?No.8333的類芽孢桿菌的發酵液離心得發酵上清液；(2)將步驟(1)所得發酵上清液與硫酸銨混合得混合液，所述混合液中硫酸銨的飽和度為50～75％，2～6℃靜置混合液0～5小時，離心收集沉淀物；(3)將步驟(2)所得沉淀物溶解，離心，取上清液，即得凝乳酶。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：杭鋒，王欽博，劉振民，陳衛，穆海波，王國驕，劉沛毅，洪青，雍靖怡，齊曉彥，
申請(專利權)人：光明乳業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31