一種克倫特羅檢測工作液及檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種克倫特羅檢測工作液及方法，該工作液為納米金膠體和三聚氰胺溶液混合后得到的膠體溶液，其中：所述的納米金膠體的膠體粒徑小于8nm；所述的三聚氰胺溶液的濃度為5μM；本發明專利技術將克倫特羅與三聚氰胺協同誘導納米金的聚集作用及納米金模擬酶的催化活性相結合，可檢測樣品中的克倫特羅；本發明專利技術涉及到的模擬酶顯色底物為TMB；涉及到的樣品有尿液和豬肉；本發明專利技術提出的克倫特羅可視化檢測方法，靈敏度高、成本較低，具有很好的應用前景，為以后的研究、生產和監管等提供了必要的支持。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分析化學
，涉及。
技術介紹
克倫特羅是β -受體激動劑的一種，用于治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺氣 腫等疾病。大劑量用在飼料中能促進脂肪分解抑制脂肪沉積，能顯著提高胴體的瘦肉率、改 善肉質和提高飼料轉化率，因此又叫"瘦肉精"。 然而，克倫特羅使用后會在畜禽組織中形成殘留，尤其是在豬的肝臟等內臟器官 殘留較高，食用后進入人體會引起心血管和中樞神經系統的毒副作用，直接危害人體健康， 因此，中國農業部早在1997年發文禁止瘦肉精在飼料和畜牧生產中使用。2001年12月27 日、2002年2月9日、4月9日，農業部分別下發文件禁止食品動物禁止使用β激動劑類藥 物作為飼料添加劑（農業部176號、193號公告、1519號條例）。由于"瘦肉精"能帶來更多經濟價值，長期以來作為非法添加藥物在畜牧生產中被 大量使用。中國最早報道的瘦肉精中毒事件是1998年供港活豬引起的，此后這類事件經常 發生，2009年4月27日，《聯合早報》報道：中國產牛肉產品（牛肉油、牛肉湯）再被韓國查 出含鹽酸克倫特羅。2011年震驚全國的河南雙匯"3. 15" "瘦肉精"事件，更是把"瘦肉精" 殘留推上了風口浪尖。"瘦肉精"殘留事件已成為我國養殖業和肉食品安全領域的毒瘤，嚴 重阻礙了我國畜牧業的發展和食品安全體系建立。 目前檢測克倫特羅的方法主要分為兩大類：儀器分析方法和免疫分析方法。儀器 分析方法主要包括氣相色譜質譜聯用法（GC-MS，GC-MS/MS)，高效液相色譜法（HPLC)，高效 液相色譜質譜聯用法（HPLC-MS，HPLC-MS/MS)，毛細管電泳法（CE)等。免疫分析方法主要 包括酶聯免疫法（ELISA)，放射免疫分析法（IA)膠體金免疫親和層析法（GICA)等。然而由 于食品樣品的復雜性和樣品數量巨大，現有的分析方法已不能滿足β -受體激動劑快速高 通量篩查的需要。因此需要建立一種快速、簡單、靈敏、低成本的方法檢測食品中的克倫特 羅；農業部235號公告規定中對克倫特羅的要求為在所有食品動物所有可食組織中不得檢 出。
技術實現思路
本專利技術針對現有技術中的缺陷和不足，提供了一種克倫特羅檢測的新思路，解決 了現有的檢測手段不能快速、多種類檢測樣品且檢測過程費時費力的問題。 為解決上述問題，本專利技術采取的技術方案為： -種克倫特羅檢測工作液，該工作液為納米金膠體和三聚氰胺溶液混合后得到的 膠體溶液，其中：所述的納米金膠體的膠體粒徑小于8nm ;所述的三聚氰胺溶液的濃度為 4 ~6 μ M0 具體的，所述的納米金膠體和三聚氰胺溶液的體積比為7~11:1。 一種克倫特羅檢測方法，將所述的克倫特羅檢測工作液與克倫特羅標準溶液、雙 氧水和TMB進行顯色反應得到標準比色液； 待測樣品溶液與權利要求1或2所述的克倫特羅檢測工作液、雙氧水和TMB進行 顯色反應得到待測樣品顯色液； 將待測樣品顯色液與標準比色液進行比對得到科倫特羅含量檢測范圍值。 具體的，所述的克倫特羅檢測工作液與克倫特羅標準溶液的體積比為4. 9~ 3. 8 : 1，克倫特羅標準溶液的濃度為0 μ M、5 μ M、10 μ M、20 μ M、30 μ M和50 μ M。 更具體的，所述的待測樣品溶液包括尿液樣品稀釋液和生物體組織樣品提取液。 進一步的，該檢測方法還包括通過吸光光度法對標準比色液進行的吸光度測定得 到吸光度與科倫特羅濃度標準曲線，再通過吸光光度法進行待測樣品顯色液的吸光度測定 得到科倫特羅濃度值。 本專利技術的有益效果為： (1)本專利技術將克倫特羅與三聚氰胺協同誘導納米金的聚集作用及納米金模擬酶的 催化活性相結合，可檢測樣品中的克倫特羅，為以后的研宄、生產和監管等提供了必要的支 持； (2)同時本專利技術通過一系列的研宄發現8nm以下的納米金膠體與三聚氰胺混合后 作為檢測工作液與不同濃度的克倫特羅混合后，催化TMB和雙氧水顯色得到顯示不同顏色 的溶液，不僅能進行尿液樣品中克倫特羅的檢測，還能進行動物組織樣品中克倫特羅的檢 測，擴大了克倫特羅能檢樣品的種類； (3)另外，本專利技術制備的檢測工作液能在4°C下保存7天，可以隨取隨用，與待檢樣 品混合再加入TMB和雙氧水顯色后即可進行檢測，與現有的先將三聚氰胺和不同濃度的克 倫特羅混合再加入納米金后顯示不同的顏色相比減少了因吸取微量液體這種操作引起的 誤差，同時操作過程比較方便，減少了一次吸取液體的操作。【附圖說明】 圖1為實施例1中僅含不同濃度的克倫特羅檢測工作液的顏色照片，從左至右克 倫特羅的濃度（μM)依次為0、5、10、20、30和50 ; 圖2為實施例1中加入雙氧水和TMB后的含不同濃度的克倫特羅檢測工作液的顏 色照片，從左至右克倫特羅的濃度（μΜ)依次為0、5、10、20、30和50 ; 圖3為實施例1中得到的含不同濃度的克倫特羅檢測體系的比色卡，從左至右克 倫特羅的濃度（μΜ)為0、5、10、20、30和50 ; 圖4為實施例2中檢測工作液中的納米金透射電鏡圖，A圖表示不含克倫特羅的 檢測工作液中納米金的透射電鏡圖，B圖表示含有克倫特羅（30 μΜ)的檢測工作液中納米 金的透射電鏡圖； 圖5為實施例3中標號的三種不同體系溶液的光譜圖，插圖為相應的照片，圖中的 標號1、2和3分別表示不同體系的樣品溶液； 圖6為實施例1中含不同濃度的克倫特羅檢測體系的標準曲線； 以下結合說明書附圖和【具體實施方式】對本專利技術做具體說明。【具體實施方式】 本專利技術所述的TMB即四甲基聯苯胺。 本專利技術的具體原理為低濃度的三聚氰胺可以吸附在納米金表面，克倫特羅 的-NH2、-NH、-OH和-Cl與三聚氰胺的烷基-NH2和芳香-NH-基團形成氫鍵，這樣克倫特羅 作為一種"交聯劑"，協同三聚氰胺引起納米金的聚集，納米金聚集后催化活性變高，催化 TMB和雙氧水顯色后的顏色變深； 同時本專利技術通過一系列的研宄發現粒徑小于8nm的納米金膠體與低濃度的三聚 氰胺作為檢測工作液，可選的三聚氰胺的濃度為〇. 5uM，與不同濃度的克倫特羅混合后再加 入TMB和雙氧水顯色后進行檢測，不僅能進行尿液樣品中克倫特羅的檢測，還能進行動物 組織樣品中克倫特羅的檢測，擴大了克倫特羅能檢樣品的種類； 本專利技術的尿液樣品溶液可通過純凈水稀釋到一定濃度后過濾得到待測尿液樣品 溶液；本專利技術的生物體組織樣品提取液，以豬瘦肉為例，可通過勻漿后的豬瘦肉加酸化乙醇 用玻璃棒攪散肉團，于振蕩器上振搖提取，離心取上清液調pH>12,用正己烷提取，合并正己 烷提取液用旋轉蒸發器濃縮至干，殘渣用純凈水溶解，用0. 25 μ m濾膜過濾得到。 實施例1 :檢測工作液的制備和克倫特羅的檢出限 1、材料/試劑： 氯金酸、硼氫化鈉、醋酸鈉和雙氧水和TMB購自國藥集團化學試劑有限公司，三聚 氰胺購自天津市科密歐化學試劑有限公司，克倫特羅購自中國食品藥品鑒定研宄所，實驗 用水均為純凈水； 2、方法： (1)制備納米金膠體：所有的玻璃儀器都需用王水浸泡過夜，純凈水沖洗，烘干備 用；向79mL水中加入25mM的氯金酸溶液lmL，在劇烈攪拌下一次性加入新制的1%的硼氫 化鈉溶液2mL，繼續避光攪拌1小時，用0. 25 μ m濾膜過濾，4°C保存備用，所制得的具有模擬 過氧化本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種克倫特羅檢測工作液，其特征在于，該工作液為納米金膠體和三聚氰胺溶液混合后得到的混合液，其中：所述的納米金膠體的膠體粒徑小于8nm；所述的三聚氰胺溶液的濃度為4～6μM。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王建龍，劉偉，張玉環，王靖，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：陜西;61