球形節桿菌生產的酮糖3-差向異構酶制造技術

本發明專利技術提供一種能夠在食品產業中使用的安全性高的差向異構酶以及酮糖的制造方法。本發明專利技術提供一種可以由屬于節桿菌(Arthrobacter)屬的微生物得到的具有序列表中的序列號1所示的氨基酸序列和下述底物特異性的酮糖3-差向異構酶：(1)將D-或L-酮糖的3位差向異構化，生成對應的D-或L-酮糖；(2)在D-或L-酮糖中對D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特異性最高。以及，一種酮糖3-差向異構酶，其將序列表中的序列號3或序列號4所示的D-或L-酮糖的3位差向異構化，生成對應的D-或L-酮糖。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種具有特定的氨基酸序列的酮糖3-差向異構酶、以及使用 該酶制造酮糖的方法，具體而言，涉及具有特定的氨基酸序列的，可以由球形節桿菌 (Arthrobacter globiformis)M30 (保藏編號 NITE BP-1111)得到的，并且具有下述（A)和 (B)的底物特異性的酮糖3-差向異構酶，進一步涉及使用了該酶的酮糖的制造方法。 (A)將D-或L-酮糖的3位進行差向異構化，生成對應的D-或L-酮糖； (B)在D-或L-酮糖中對D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特異性最高。
技術介紹
D-阿洛酮糖是D-果糖的差向異構體，在甜味的強度和種類方面與D-果糖極其相 似。但是D-阿洛酮糖與D-果糖不同，在體內吸收時幾乎不被代謝，熱量貢獻低。在專利文 獻1中記載了能夠將D-阿洛酮糖作為低卡路里甜味劑有利地利用于低卡路里飲食品的制 造中。即，D-阿洛酮糖可以作為減肥食品的有效成分使用。被作為非砂糖甜味劑廣泛利用 的糖醇類如果攝取超過規定量，則會引起腹瀉等的副作用，但是D-阿洛酮糖這樣的副作用 少。進一步，由于D-阿洛酮糖在人體內幾乎不被代謝，因此，熱量值大致接近零，通過抑制 脂質合成酶的活性而具有減少腹部脂肪的功能。因此，D-阿洛酮糖也可以作為有益于體重 減少的甜味劑使用（例如，參照非專利文獻1和2)。另外，在專利文獻2中記載了由于D-阿 洛酮糖具有抑制血糖上升作用，因此，可以有利地用于健康食品、糖尿病患者用飲食品、瘦 身用飲食品等中。從這樣的觀點出發，D-阿洛酮糖集中了作為健康食品、減肥甜味劑的多個 關注點，在食品產業中，對于高效且安全地生成D-阿洛酮糖的方法的開發的必要性提高。 另一方面，在非專利文獻3中公開了來自菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii) ST-24的D-酮糖3-差向異構酶，并且記載了可以通過利用該酶由D-果糖來制造 D-阿洛酮 糖。然而，正如該酶的別名被稱為D-塔格糖3-差向異構酶（D-tagatose 3-epimerase)那 樣，已知其對D-塔格糖的特異性最高，對D-果糖的作用比較弱。另外，菊苣假單胞菌是植 物病原性微生物，D-酮糖3-差向異構酶生產能力非常低，因此，還不能說其適合利用于工 業上。因此尋求與屬于假單胞菌屬的微生物不同的、酮糖3-差向異構酶產生能力高且在食 品生產中在安全性上沒有問題的微生物，以及對D-果糖的特異性高且適于D-阿洛酮糖的 制造的新型酮糖3-差向異構酶。 因此，在專利文獻3中，以提供一種新型的酮糖3-差向異構酶及其制造方法、編碼 該酶的DNA、含有該DNA的重組DNA以及轉化體、以及使用了該酶的酮糖的制造方法為課題， 并通過提供能夠由屬于根瘤菌屬（Rhizobium)的微生物得到的酮糖3-差向異構酶及其制 造方法、編碼該酶的DNA和含有該DNA而成的重組DNA以及轉化體、以及利用該酶將D-或 L-酮糖的3位差向異構化，并制造對應的D-或L-酮糖的方法，從而解決了上述課題。另 外，在專利文獻4中開發了使用來自根癌農桿菌(ARrobacterium tumefaciens)的D-阿洛 酮糖差向異構酶（以下稱為阿洛酮糖3-差向異構酶）的D-阿洛酮糖的生成方法。 如上所述，為了處理上述問題，對使用D-果糖作為底物，用酶生成D-阿洛酮糖的 方法進行了研宄。然而，至今開發的方法在用于作為食品的D-阿洛酮糖的生成中，在安全 性方面問題點還很多。 現有技術文獻 專利文獻 專利文獻1 :日本特開2001-011090號公報 專利文獻2 :日本特開2005-213227號公報 專利文獻3 :W02007/058086號公報 專利文獻4 :日本特表2008-541753號公報 非專利文獻 非專利文獻 I :Matsuo, T.，Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori and H. Suzuki1Asia Pac. J. Clin. Nutr. , 10:233-237(2001) 非專利文獻2:]\^七8110，1'.&11(11(.121111101'；\〇1；[11· Nutr.， 13:S127(2004) 非專利文獻 3 ： K e n Izumori et al, Biosci. Biotech. Biochem.，57, 1037-1039(1993)
技術實現思路
專利技術所要解決的課題 本專利技術的課題在于提供從作為在制造食品時使用被認可的、收錄于現有添加物名 冊收錄清單中的菌種并且幾乎沒有毒性的菌種中，以高收率取得催化從D-果糖向D-阿洛 酮糖的異構化的新型酮糖3-差向異構酶，以及使用了該酶的酮糖的制造方法。 本專利技術者們每次有機會就采集各地的土壤，從其中分離微生物，持續探索具有酮 糖3-差向異構酶產生能力的屬于假單胞菌屬的微生物以外的微生物。除了上述日本現有 添加物名冊收錄清單以外，還著眼于在歐洲和美國作為食品使用被認可的清單中記載的菌 種中幾乎沒有毒性的菌種，持續專門探索。 其結果，在大量分離的菌株中發現了產生新型的酮糖3-差向異構酶的屬于節桿 菌(Arthrobacter)屬的微生物。另外，來自該微生物的新型的酮糖3-差向異構酶具有作 用于D-或L-酮糖的3位，催化向對應的D-或L-酮糖進行差向異構化的廣泛的底物特異 性，并意外地發現其在D-或L-酮糖中，對D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特異性最高，適于 由D-果糖制造 D-阿洛酮糖。從而確立了能夠通過屬于節桿菌(Arthrobacter)屬的微生 物得到的新型酮糖3-差向異構酶及其制造方法，并且確立利用了該酶的酮糖的轉換方法 以及酮糖的制造方法，從而完成了本專利技術。 即，本專利技術的目的在于提供一種能夠由屬于節桿菌(Arthrobacter)屬的微生物 得到的酮糖3-差向異構酶，并且提供一種利用該酶將D-或L-酮糖的3位進行差向異構化， 制造對應的D-或L-酮糖的方法。 屬于節桿菌(Arthrobacter)屬的微生物的新型酮糖3_差向異構酶產生能力比較 高，并且和菊苣假單胞菌不同，不具有植物病原性。另外，能夠由該微生物得到的本專利技術的 酮糖3-差向異構酶尤其能夠良好地催化D-阿洛酮糖和D-果糖間的相互轉換，因此，對于 由D-果糖制造 D-阿洛酮糖有用。 解決課題的技術手段 本專利技術以下述（1)至（5)中記載的酮糖3-差向異構酶為要點。 (1) -種酮糖3-差向異構酶，其中，所述酮糖3-差向異構酶來自作為球形節桿菌 M30(保藏編號為NITE BP-1111)的微生物，作為部分氨基酸序列，包含序列表中的序列號1 所示的氨基酸序列，具有下述（A)、(B)的底物特異性，并且具有下述（A)~（B)的物理化學 性質： (A)將D-或L-酮糖的3位差向異構化，生成對應的D-或L-酮糖； (B)在D-或L-酮糖中對D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特異性最高。 (2)如上述⑴所述的酮糖3-差向異構酶，其中，具有下述（a)~（f)的物理化學 性質， (a)分子量： 通過SDS-PAGE測定的亞單位的分子量為約32kDa，通過凝膠過濾法測定的分子量 為120kDa，是亞單位的分子量為32kDa的同源四聚體（homotetrame本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種酮糖3?差向異構酶，其中，所述酮糖3?差向異構酶來自作為球形節桿菌M30的微生物，作為部分氨基酸序列包含序列表中的序列號1所示的氨基酸序列，具有下述(A)、(B)的底物特異性，并且具有下述(A)～(B)的物理化學性質，其中，所述球形節桿菌M30的保藏編號為NITE?BP?1111，(A)將D?或L?酮糖的3位差向異構化，生成對應的D?或L?酮糖；(B)在D?或L?酮糖中對D?果糖和D?阿洛酮糖的底物特異性最高。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何森健，P·K·古洛帕利，新谷知也，吉川諒，
申請(專利權)人：松谷化學工業株式會社，株式會社希少糖生產技術研究所，
類型：發明
國別省市：日本;JP