本發明專利技術公開一種基于代謝組學數據建立分析預測糖尿病認知功能障礙平臺的方法，是采用高效液相色譜-質譜聯用技術分離并鑒定健康人、糖尿病患者但未患認知功能障礙及糖尿病患者但患有認知功能障礙三組血漿，利用軟件對所分離得到的物質分別進行主成分分析和偏最小二乘方判別分析，確定差異性代謝產物并對其結構進行鑒定，選擇顯著的差異性代謝產物構成分析預測糖尿病認知功能障礙平臺。可以及時根據糖尿病患者的血漿分析預測糖尿病認知功能障礙，及早發現及早治療，可降低糖尿病認知功能障礙的發病率，避免由糖尿病認知功能障礙引起的一系列家庭與社會問題。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種分析預測平臺的建立方法，尤其是一種基于代謝組學數據建立分 析預測糖尿病認知功能障礙平臺的方法。
技術介紹
糖尿病認知功能障礙作為糖尿病的常見并發癥，主要癥狀以學習能力下降、 記憶損害為主，嚴重可發展為癡呆。雖然并不是糖尿病中最嚴重的并發癥，但由此病引 起的后果是非常嚴重的，譬如糖尿病患者忘記吃藥，將會加重病情等。糖尿病患者患上 認知功能障礙的幾率比正常人高50%，II型糖尿病中年患者患癡呆的長期風險顯著提 高；65歲以上的老年人12~25%都患有糖尿病，世界范圍內10到15個癡呆患者就有1 個是由II型糖尿病引起，如果把糖尿病前期也納入考慮，大約可達到疒10個患者中就 有1個。目前，臨床上采用MoCA和麗SE方法來評價糖尿病認知功能障礙，缺乏血液 學證據。 高效液相色譜作為一種分離設備的聯用技術被廣泛的使用，其中以高效液相色譜 質譜聯用最為常見。高效液相色譜-質譜聯用技術始于20世紀70年代，其分析的物質多 數直接進樣在HPLC上得到分離，然后在MS上獲得準確的定性和定量，從而大大地縮短了 分析時間，提高了分析的靈敏度和準確性。 但是，迄今為止還沒有關于以高效液相色譜-質譜聯用技術分析血漿內源性成分 并獲得代謝組學數據，從而建立分析預測糖尿病認知功能障礙平臺的方法的相關報道。
技術實現思路
本專利技術是為了解決現有技術存在的上述技術問題，提供一種基于代謝組學數據建 立分析預測糖尿病認知功能障礙平臺的方法。 本專利技術的技術解決方案是：一種基于代謝組學數據建立分析預測糖尿病認知功能 障礙平臺的方法，其特征在于按照如下步驟進行： a. 取冷凍儲存的三組血漿樣本，分別為A組健康人；B組糖尿病患者但未 患認知功能障礙；C組糖尿病患者但患有認知功能障礙；將三組血漿樣本均置于室溫 下解凍15min，渦漩震蕩5s ;分別取每個樣本100 ill加入300 ill HPLC級甲醇，渦漩震蕩 30s，4° C靜置20min;對所有樣本進行冷凍離心，12000rpm，4° C，15min，取每個樣本的上 清液； b. 將每個樣本的上清液分別進入LC/MS進行分離； 色譜條件：分離色譜柱為C18色譜柱，分離條件為：柱溫為40°C ;流速0. 4 ml/min ;流 動相組成A :水+0. 1%甲酸，B :乙腈+0. 1%甲酸；梯度洗脫程序見表1 ;進樣量為5 yl，自動 進樣器溫度4°C ; 表1質譜條件：采用ESI正離子模式進行檢測，以氮氣作為霧化、錐孔氣；飛行管檢測模式V 型； 正離子模式條件：毛細管電壓4 kV、錐孔電壓35 kV、離子源溫度KKTC;脫溶劑氣溫度 350°C、反向錐孔氣流50 L/h、脫溶劑氣600L/h、萃取錐孔4 V;離子掃描時間0.03 s、掃描 時間間隔0.02 s、數據采集范圍：5(T100 0 m/z ;應用亮氨酸-腦啡肽作為鎖定質量，正離子 模式下產生+離子556. 2771 Da ; c. 數據處理： 對所有原始質譜數據進行預處理并導出mz格式數據；具體步驟是在R軟件平臺下采用 xcms程序代碼進行數據預處理，包括基線過濾、峰識別，進行保留時間校正、峰對齊和質譜 碎片歸屬分析，最后在EXCEL2007軟件中進行后期編輯，包括來自于柱流失和樣本制備造 成的雜質峰剔除和定量離子選擇，將最終結果組織為二維數據矩陣，包括變量、觀察量和峰 強度； d. 數據分析： 將所有數據歸一化到總信號積分，將編輯后的數據矩陣導入版本11. 〇的Simca-P軟 件，分別進行主成分分析和偏最小二乘方判別分析； e. 差異性代謝產物確定及其結構鑒定： 采用PLS-DA模型第一主成分的VIP值，并結合學生氏t檢驗的p值確定差異性代謝產 物并對其結構進行鑒定； f. 分析預測平臺的建立： 選擇顯著的差異性代謝產物構成預測平臺，具體步驟： f. 1分別按照差異性代謝產物的VIP值、ROC曲線下的面積和倍數變化的絕對值降序排 列，P值升序排列，形成四個列表； f. 2挑選所有列表中的前20%的變量為分析預測糖尿病認知功能障礙的標準值，構成 預測平臺。 本專利技術是采用高效液相色譜-質譜聯用技術分離并鑒定健康人、糖尿病患者但未 患認知功能障礙及糖尿病患者但患有認知功能障礙三組血漿，利用軟件對所分離得到的物 質分別進行主成分分析和偏最小二乘方判別分析，確定差異性代謝產物并對其結構進行鑒 定，選擇顯著的差異性代謝產物構成分析預測糖尿病認知功能障礙平臺。可以及時根據糖 尿病患者的血漿分析預測糖尿病認知功能障礙，及早發現及早治療，可降低糖尿病認知功 能障礙的發病率，避免糖尿病認知功能障礙進一步惡化及帶來的嚴重后果。【附圖說明】 圖1是本專利技術實施例1主成分分析PCA得分圖。 圖2是本專利技術實施例1采用PLS-DA對AB兩組樣本分析得分圖。 圖3是本專利技術實施例1采用PLS-DA對AC兩組樣本分析得分圖。 圖4是本專利技術實施例1采用PLS-DA對BC兩組樣本分析得分圖。【具體實施方式】 按照如下步驟進行： a. 取冷凍儲存的三組血漿樣本，分別為A組健康人；B組糖尿病患者但未 患認知功能障礙；C組糖尿病患者但患有認知功能障礙；每組取24個樣本，將三組血漿 樣本均置于室溫下解凍15min，渦漩震蕩5s ;分別取每個樣本100 ill加入300 ill HPLC級 甲醇，渦漩震蕩30s，4° C靜置20min ;對所有樣本進行冷凍離心，12000rpm，4° C，15min， 取每個樣本的上清液； b. 將每個樣本的上清液分別進入LC/MS進行分離； LC/MS儀器分析平臺為Agilent, 1290InfinityLC, 6530UHDandAccurate-Mass Q-TOF/MS。 色譜條件：分離色譜柱為C18色譜柱（Agilent, 100 mmX2. 1臟，1.811111)，分離 條件為：柱溫為40°C ;流速0. 4 ml/min ;流動相組成A :水+0. 1%甲酸，B :乙腈+0. 1%甲酸； 梯度洗脫程序見表1 ;進樣量為5 yl，自動進樣器溫度4°C ; 表1質譜條件：采用ESI正離子模式進行檢測，以氮氣作為霧化、錐孔氣;飛行管檢測模式V型； 正離子模式條件：毛細管電壓4 kV、錐孔電壓35 kV、離子源溫度KKTC;脫溶劑氣溫度 350°C、反向錐孔氣流50 L/h、脫溶劑氣600L/h、萃取錐孔4 V;離子掃描時間0.03 s、掃描 時間間隔0.02 s、數據采集范圍：5(T100 0 m/z ;應用亮氨酸-腦啡肽作為鎖定質量，正離子 模式下產生+離子556. 2771 Da ; c. 數據處理： 通過安捷倫工作站MassHunter (Version B 03. 01)對所有原始質譜數據進行預處理 并導出mz格式數據；具體步驟是在R軟件平臺下采用xcms程當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于代謝組學數據建立分析預測糖尿病認知功能障礙平臺的方法，其特征在于按照如下步驟進行：a.?取冷凍儲存的三組血漿樣本，分別為A組健康人；B組糖尿病患者但未患認知功能障礙；C組糖尿病患者但患有認知功能障礙；將三組血漿樣本均置于室溫下解凍15min，渦漩震蕩5s；分別取每個樣本100μl加入300μl?HPLC級甲醇，渦漩震蕩30s，4°C靜置20min；對所有樣本進行冷凍離心，12000rpm,?4°C，15min，取每個樣本的上清液；b．將每個樣本的上清液分別進入LC/MS進行分離；色譜條件：分離色譜柱為C18色譜柱，分離條件為：柱溫為40℃；流速0.4?ml/min；流動相組成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脫程序見表1；進樣量為5μl，自動進樣器溫度4℃；表1Time (min)Flow rate (ml/min)A (%)B (%)00.498220.4982170.4595190.4595質譜條件：采用ESI正離子模式進行檢測，以氮氣作為霧化、錐孔氣；飛行管檢測模式V型；正離子模式條件：毛細管電壓4?kV、錐孔電壓35?kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度350℃、反向錐孔氣流50?L/h、脫溶劑氣600L/h、萃取錐孔4?V；離子掃描時間0.03?s、掃描時間間隔0.02?s、數據采集范圍：50~1000?m/z；應用亮氨酸?腦啡肽作為鎖定質量，正離子模式下產生[M+H]+離子556.2771?Da；c.數據處理：對所有原始質譜數據進行預處理并導出mz格式數據；具體步驟是在R軟件平臺下采用xcms程序代碼進行數據預處理，包括基線過濾、峰識別，進行保留時間校正、峰對齊和質譜碎片歸屬分析，最后在EXCEL2007軟件中進行后期編輯，包括來自于柱流失和樣本制備造成的雜質峰剔除和定量離子選擇，將最終結果組織為二維數據矩陣，包括變量、觀察量和峰強度d.?數據分析：將所有數據歸一化到總信號積分，將編輯后的數據矩陣導入版本11.0的Simca?P軟件，分別進行主成分分析和偏最小二乘方判別分析；e.?差異性代謝產物確定及其結構鑒定：采用?PLS?DA模型第一主成分的VIP值，并結合學生氏t檢驗的p值確定差異性代謝產物并對其結構進行鑒定；f.?分析預測平臺的建立：選擇顯著的差異性代謝產物構成預測平臺，具體步驟：f.1分別按照差異性代謝產物的VIP值、ROC曲線下的面積和倍數變化的絕對值降序排列，P值升序排列，形成四個列表；f.2挑選所有列表中的前20%的變量為分析預測糖尿病認知功能障礙的標準值，構成預測平臺。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：戰麗彬，張琳，隋華，梁麗娜，路曉光，
申請(專利權)人：大連醫科大學附屬第二醫院，
類型：發明
國別省市：遼寧;21
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