本發明專利技術涉及陽離子脂質體小分子干擾RNA(SiRNA)轉染試劑領域，特別涉及一種含有天然薯蕷甾醇的陽離子脂質體、制備方法及其作為SiRNA轉染試劑的應用。本發明專利技術所提供的一種含有天然薯蕷甾醇的陽離子脂質體，由天然薯蕷甾醇陽離子脂質與輔助脂質二油酰磷脂酰乙醇胺復合后直接超聲水化形成，制備方法簡便，易實現規?；苽洹Ｗ鳛镾iRNA基因轉染試劑，本發明專利技術提供的一種含有天然薯蕷甾醇的陽離子脂質體與市售商品化基因轉染試劑bPEI-25k相比具有明顯較低的細胞毒性，且具有相對高效的SiRNA基因轉染效果，可以作為新型類脂質基因載體功能試劑在SiRNA的轉染中得到應用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及合成脂質體基因輸送功能載體材料領域，特別涉及一種含有天然薯蕷 甾醇的陽離子脂質體、制備方法及其作為小分子干擾基因 Bcl-2SiRNA轉染試劑的應用。
技術介紹
近年來，基于小分子干擾RNA(SiRNA)技術的基因治療方法引起了人們的極大興 趣。由于SiRNA可直接在胞漿內進行表達，具有起效快速且給藥的時間間隔靈活可控的優 點。因此，通過SiRNA輸送進行基因治療相關的生物醫學技術得到了迅速的發展，該技術可 單獨使用或與其它治療手段聯用以治療系列基因缺陷型疾病，如遺傳型疾病、病毒感染性 疾病、以及腫瘤等。在腫瘤治療方面，近來研宄較多的小分子干擾RNA為Bcl-2 SiRNA (正 義鏈 GUA CAU CCA UUA UAA GCU Gdtdt，反義鏈 CAG CUU AUA AUG GAU GUA Cdtdt)，其可以 通過抑制bcl-2抗凋亡基因的表達有效抑制Bcl-2蛋白的合成，從而恢復細胞的正常凋亡 調控能力，最終達到抑制腫瘤生長的目的。實現SiRNA輸送基因治療的關鍵在于以下兩個 方面：其一為SiRNA基因序列的選擇，其須對靶mRNA基因產生高度序列特異性的結合；其 二是SiRNA須在遞送過程中保持穩定，不被體液、細胞內外基質中的酶降解，亦須避免其與 環境中的生物活性物種產生特異性的結合。因此，目前作為SiRNA基因輸送的載體大多為 合成陽離子有機功能分子、高分子，其實現基因負載與輸送的原理為利用載體陽離子功能 分子、高分子中質子化氨基官能團的正電荷（+)與SiRNA基因序列中磷酸基團所攜帶的負 電荷（_)的靜電相互作用，結合組裝形成穩定的聚集體納米復合物粒子（Polyplex)，保護 所負載的SiRNA不易被細胞內外的核酸酶降解，同時可提高聚集復合體粒子在體內的穩定 性，從而實現提高SiRNA基因轉染的效率。上述因素使SiRNA基因高效輸送的相關功能載 體材料的研宄成為生命科學和材料科學交叉領域最為活躍的研宄方向之一。 然而，到目前為止，雖然國內外已經開發報道了多種陽離子功能分子如陽離子聚 合物、陽離子脂質體等，并作為載體應用于體外或體內細胞/組織水平的SiRNA輸送與轉染 研宄，但在實際應用中，大多數脂質陽離子功能分子在血液循環中不穩定，容易被網狀內皮 系統吞噬后清除而導致其失活。且許多陽離子載體具有免疫原性，可刺激、誘導細胞的免疫 應激反應，進而導致毒副作用。以上這些因素限制了陽離子功能分子在SiRNA基因治療中 的進一步應用。因此，如何改善合成基因載體的生物相容性、減低毒性及增強SiRNA基因的 轉染效果，具有重要的研宄和實用價值。 近年來，人們發現，研宄采用具有生物相容性的脂質化合物構建新型陽離子生物 載體成為合成功能脂質分子研宄開發應用的重要方向之一。許多具有重要生理活性的天 然甾體化合物，具有較強的疏水性和良好的生物相容性，可合成制備新型脂質陽離子有機 功能分子，降低合成脂質陽離子的細胞毒性，有可能應用作為新型生物相容性基因載體。近 年來，國內外合成報道了多種由天然留體衍生的陽離子脂質，如膽固醇陽離子氨基脂質，膽 固醇陽離子多肽（Int. J. Pharm. 2014, 468, 83, J. Control. Release, 2013, 172, 159, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 3837)等，它們表現出了良好的藥物和基因負載、可控緩釋以及 基因輸送與細胞內轉染效果（Mol. Pharm. 2012, 9, 3579)。在此基礎上，人們又繼續合成 了其它天然留體衍生的陽離子脂質，以圖發展更為有效可控的基因輸送載體體系。在相 關前期的工作中，申請者專利技術了系列基于二硫鍵的膽固醇脂質基因載體（Biomaterials 2011，11,3507 ;中國專利：ZL201010182428. 4)，發現二硫化學鍵的引入對降低合成脂質載 體的細胞毒性具有重要作用。進一步制備了系列基于天然生物相容性膽固醇的類脂質陽離 子有機功能分子作為基因轉染試劑（中國專利申請號201110040189. 3)應用于質粒DNA的 高效細胞轉染。隨后發展了系列精氨酸修飾的動物固醇陽離子脂質體其表現出了非常高的 DNA轉染效率（中國專利申請號201410060042. 4)。然而，上述作為基因輸送載體的合成甾 體類脂質大多集中應用于質粒DNA的細胞轉染方面，用于SiRNA轉染的甾體類脂質還較少。 因此，研宄和開發生物相容性好、轉染效率高的留體類脂質陽離子有機功能分子，進一步拓 展其作為小分子干擾SiRNA功能載體的應用，對于開發具有我國自主知識產權的生物功能 載體材料具有重要意義，其也是本專利技術所致力解決的目標。 專利技術的內容 本專利技術的目的之一是提供一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體。 本專利技術的目的之二是提供上述一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體的制備方 法。 本專利技術的目的之三是提供一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體作為SiRNA基 因輸送載體功能材料的用途。 根據本專利技術所提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體，其由下列兩組分構 成： 其中，天然薯蕷留醇精氨酸陽離子脂質（Dios-Arg)和輔助脂質二油酰磷脂酰乙 醇胺（DOPE)的摩爾比為1:0.1~5.0,優先摩爾比為1:0. 5~2。 本專利技術的上述含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體是一種50~500納米的陽離子 脂質體，優選為100~200納米的陽離子脂質體。 本專利技術的上述含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體具有10~50毫伏的表面電位， 優選20~40暈伏的表面電位。 依據本專利技術中所述的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體的制備方法，主要為 以下步驟： 將一定配比的天然薯蕷留醇精氨酸陽離子脂質Dios-Arg和輔助脂質二油酰磷脂 酰乙醇胺DOPE溶于充分脫水干燥的色譜級有機溶劑中，隨后加入少量醇進行增溶，在室 溫~90°C下蒸除去有機溶劑，如采用旋轉蒸發儀中蒸除去有機溶劑，待瓶底形成一層均勻 的脂質薄膜后；加入一定量的去離子水，超聲水化2~4h后得到一種含有天然薯蕷留醇的 陽離子脂質體。 根據本專利技術中所提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體的制備方法中， 所述的天然薯蕷留醇精氨酸陽離子脂質和輔助脂質二油酰磷脂酰乙醇胺的摩爾比為 1:0. 1~5. 0,優先摩爾比為1:0. 5~2。 根據本專利技術中所提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體的制備方法中， 所述的天然薯蕷留醇精氨酸陽離子脂質，有機溶劑，醇和去離子水的毫摩爾和體積比為 Immol :80 ~150ml :0· 5 ~2ml :80 ~120ml ;優先選擇 lmmol :100ml :1ml :100ml。 根據本專利技術中所提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體的制備方法中，所 述的有機溶劑包括乙酸乙醋、四氫呋喃、1，4_二氧六環、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、乙腈、丙 酮或它們的混合有機溶劑。 根據本專利技術中所提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體的制備方法中，所 述的醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、正戊醇、異戊醇、叔戊醇或 它們的混合醇溶劑。 根據本專利技術提供的一種含有天然薯蕷留醇的陽離子脂質體本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種含有天然薯蕷甾醇的陽離子脂質體，其由下列兩組分構成：其中，天然薯蕷皂苷元精氨酸陽離子脂質Dios?Arg與輔助脂質二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE的摩爾比為1:0.1～5.0；是具有50～500納米尺寸的陽離子脂質體。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：盛瑞隆，曹阿民，孔令丹，史向陽，朱曉夏，
申請(專利權)人：中國科學院上海有機化學研究所，
類型：發明
國別省市：上海;31
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