本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種基于核酸外切酶Ⅲ的汞離子檢測新方法，包括（1）將兩段能夠?qū)x子特異性識別且富含T堿基的DNA片段與待測樣品混合，兩段DNA片段在待測樣品中的Hg2+作用下結(jié)合成3'端閉合的雙鏈DNA；（2）核酸外切酶III酶切雙鏈DNA；（3）對剩余的沒有被酶切的DNA片段進(jìn)行熒光定量PCR擴增；（4）根據(jù)熒光檢測結(jié)果確定Hg2+濃度。本發(fā)明專利技術(shù)設(shè)計了一張汞離子生物傳感器，用以實現(xiàn)水中汞離子的簡單、快速、高靈敏檢測。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
專利技術(shù)屬于分析化學(xué)
和食品安全
，涉及一種基于核酸外切酶III的 汞離子檢測新方法。
技術(shù)介紹
汞主要以無機汞和有機汞等形態(tài)存在于自然界中，無機汞在自然界中會通過甲基 化的作用轉(zhuǎn)化為有機汞。不同狀態(tài)的汞對人體的危害不同，其中有機汞對人的身體危害最 大。汞會通過食物鏈富集的作用在人體內(nèi)積累，給人類身體健康帶來危害。例如：嚴(yán)重?fù)p害 人體的大腦和神經(jīng)系統(tǒng)，給免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、腎和肺等器官功能造成嚴(yán)重影響等，因此 開發(fā)一種簡單快速檢測汞離子的新方法仍然是十分必要的。 汞離子的濃度測定傳統(tǒng)方法主要有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、 分光光度法、伏安法等。這些傳統(tǒng)方法雖然各具優(yōu)點，但是在實際應(yīng)用中仍是有許多局限 性，如儀器設(shè)備昂貴、預(yù)處理復(fù)雜、還需要熟練的技工等。 自關(guān)于T-Hg2+-T特異型結(jié)構(gòu)被報道以來，一些科研工作者開始關(guān)注T-Hg2+-T這樣 的特異型結(jié)構(gòu)，T-Hg 2+-T特異性結(jié)合作用力要大于"A" "T"堿基互補配對作用力，并報道了 一些利用T-Hg2+-T特異型結(jié)構(gòu)新型汞離子傳感器這類傳感器具有選擇性好，特異性好的優(yōu) 點，成為最近人民研宄的熱點。 核酸外切酶III能夠作用于3'端閉合的雙鏈DNA，并沿著3' 一 5'的方向逐步切 去單核苷酸。核酸外切酶III的這個性質(zhì)已經(jīng)被應(yīng)用于核酸分子和有機小分子的檢測。在 本專利技術(shù)中，我們設(shè)計了一種基于核酸外切酶III的熒光分析法超靈敏檢測汞離子的新方法。 基于T-T堿基錯配兩個DNA片段形成3'端閉合的雙鏈DNA，利用核酸外切酶III能夠作用 于3'端閉合的雙鏈DNA，并沿著3' 一5'的方向逐步切去單核苷酸的性質(zhì)，結(jié)合實時熒光定 量PCR的熒光放大效應(yīng)，建立了一種檢測水溶液中汞離子的新方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種基于核酸外切酶III的汞離子檢測新方法，實現(xiàn)水中汞離 子的簡單、快速、高靈敏檢測。 本專利技術(shù)通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種基于核酸外切酶III的汞離子檢測新方法， 包括： (1) 將兩段能夠?qū)x子特異性識別且富含T堿基的DNA片段與待測樣品混合，兩段 DNA片段在待測樣品中的Hg2+作用下結(jié)合成3'端閉合的雙鏈DNA ; (2) 核酸外切酶III酶切雙鏈DNA ; (3) 對剩余的沒有被酶切的DNA片段進(jìn)行熒光定量PCR擴增； (4) 根據(jù)焚光檢測結(jié)果確定Hg2+濃度。 進(jìn)一步的，所述的兩段能夠?qū)x子特異性識別且富含T堿基的DNA片段的序列 具有如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高利用本發(fā) 明方法進(jìn)行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。 進(jìn)一步的，所述的熒光定量PCR擴增的引物序列具有如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高利用本專利技術(shù)方法進(jìn)行汞離子濃度檢測的效 率和靈敏度。 進(jìn)一步的，所述的汞離子的濃度為2-200nM。由此，可以進(jìn)一步提高利用本專利技術(shù)方 法進(jìn)行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。 進(jìn)一步的，所述的汞離子的濃度為5-100nM。由此，可以進(jìn)一步提高利用本專利技術(shù)方 法進(jìn)行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。 進(jìn)一步的，基于下列線性方程，確定所述樣品中汞離子的濃度： y=l. 03χ+4· 66， y為不同汞離子濃度下擴增曲線的循環(huán)數(shù)，χ為相應(yīng)汞離子的濃度。由此，可以進(jìn)一步 提高利用本專利技術(shù)方法進(jìn)行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。 根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，確定所述樣品中的汞離子濃度是通過將所述體系的熒光檢 測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較而完成的，其中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是基于已知汞離子濃度分別為2 nM、5 nM、10 nM、20 nM、50 nM、100 nM、200 nM的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行平行實驗而建立的。由此，可 以進(jìn)一步提高利用本專利技術(shù)方法進(jìn)行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。 本專利技術(shù)的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本專利技術(shù)的實踐了解到。【附圖說明】 圖1添加不同濃度的汞離子，并做實時熒光定量PCR，得到其擴增曲線(汞離子濃 度分別取 2 nM、5 nM、10 nM、20 nM、50 nM、100 nM)。 圖2汞離子檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。【具體實施方式】 下面結(jié)合實施例對本專利技術(shù)的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)理解為對本專利技術(shù)的 限制： 實施例1設(shè)計與合成相應(yīng)的寡核苷酸片段 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計兩段能夠?qū)x子特異性識別且富含T堿基的DNA片段，根據(jù) 此序列來設(shè)計實時熒光定量PCR用的上下游引物。序列通過DNA合成儀制備。 模版 DNA :5' - AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTT AGCGCCTTACTTGTTTGTTG-3' （SEQ ID N0:1) 互補 DNA :5' - CTTCTTTCTTGTAAGGCGCTAAGAAACATCGCCACGGG GAAGGCGTACTCGCG -3' （SEQ ID N0:2) 上游引物：5' -AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3'（SEQ ID NO :3) 下游引物：5' -GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3，（SEQ ID NO :4) 實施例2 T-Hg2+-T雜交反應(yīng) 首先PCR管加入模板DNA和互補DNA的混合液，隨后依次加入適量的Hg2+離子標(biāo)準(zhǔn)溶 液使其最終濃度分別為2、5、10、20、50、100、200 11]\1，反應(yīng)30 1^11后。模板0嫩和互補0嫩 通過T-Hg2+-T特異性結(jié)構(gòu)形成3'端閉合的雙鏈DNA。 實施例3核酸外切酶III的酶催化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 依次向上述PCR管中加入核酸外切酶III 0.1 μL，反應(yīng)90 S，隨之整個體系在恒溫金屬 浴中98°C反應(yīng)10 min，讓核酸外切酶III失活，結(jié)束核酸外切酶III對模板DNA的剪切。隨后 加入適量的PCR混合液，上、下游引物后在CFX96?實時熒光定量PCR中完成實驗。由于加 入的Hg 2+離子濃度不同，導(dǎo)致了不同數(shù)量的模板DNA被核酸外切酶III剪掉，用于PCR擴增的 模板DNA的濃度也隨之不同，故而得到不同的擴增曲線（圖1)。汞離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：利 用實時熒光定量PCR儀測定不同汞離子濃度下擴增曲線的循環(huán)數(shù)，根據(jù)測定的不同汞離子 濃度下擴增曲線的循環(huán)數(shù)，繪制汞離子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2)，本傳感器的線性范圍5-100 nM，檢測限為3 nM。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=1.03x+4.66，y為不同汞離子濃度下擴增曲 線的循環(huán)數(shù)，X為相應(yīng)汞離子的濃度，線性相關(guān)性>〇. 99。 實施例4汞離子的特異性測定 步驟同（2)，依次向模板DNA和互補DNA的混合液中加入Hg2+、Cu2+、Cd2+、Pb 2+、Ni2+、Fe2+ 標(biāo)準(zhǔn)液，使其最終濃度均為100 nM，在37° C反應(yīng)30分鐘。隨后按照步驟（3)完成實驗。 由實驗結(jié)果得知這種基于PCR技術(shù)的汞離子檢測新技術(shù)具有很高的特異性。 實施例5實際添加樣品的測定 向自來水樣品中分別添加適量的汞離子標(biāo)準(zhǔn)液，使其最終濃度分別為5、10、20、50 nM， 采用基于核酸外切酶III的汞離子檢測新方法測定實際樣本中的汞離子的回本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種基于核酸外切酶Ⅲ的汞離子檢測新方法，其特征在于，包括：（1）將兩段能夠?qū)x子特異性識別且富含T堿基的DNA片段與待測樣品混合，兩段DNA片段在待測樣品中的Hg2+作用下結(jié)合成3'端閉合的雙鏈DNA；（2）核酸外切酶III酶切雙鏈DNA；（3）對剩余的沒有被酶切的DNA片段進(jìn)行熒光定量PCR擴增；（4）根據(jù)熒光檢測結(jié)果確定Hg2+濃度。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱穎越，鄧大慶，朱敏，李海霞，蔡義林，袁愛夢，王立梅，齊斌，
申請(專利權(quán))人：常熟理工學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32
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