一種利用重組蛋白體外制備豬樹突狀細胞的方法技術

本發明專利技術涉及生物工程領域，分別公開了一種高效制備豬白細胞介素4(IL-4)和一種高效制備豬粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)重組蛋白的方法，以及利用這兩種重組蛋白體外制備豬樹突狀細胞的應用。本發明專利技術方法簡單，易操作，成本低，誘導細胞純度高，具有良好應用前景和使用價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，屬于生物技術基因 工程領域。具體涉及一種高效制備豬白細胞介素4 (IL-4)和一種高效制備豬粒細胞-巨噬 細胞集落刺激因子（GM-CSF)重組蛋白的方法，以及利用這兩種重組蛋白體外制備豬樹突 狀細胞的應用。 二、
技術介紹
樹突狀細胞是目前已知的體內功能最強的抗原呈遞細胞（APC)，通過直接激活并 調控T淋巴細胞的免疫功能，對機體免疫反應發揮重要的調節作用，因此在免疫學研宄中 受到廣泛的重視。 樹突狀細胞可以來源于外周血和臍帶血的單核細胞，也可以從骨髓液的前體細胞 分化而來，在不同的發育階段具有不同的表型特征和生理功能。雖然樹突狀細胞在各種組 織中都有分布，但含量稀少，而進行表型特征、抗原攝取、抗原遞呈和免疫排斥及免疫耐受 等基礎研宄需要使用大量的樹突狀細胞。運用細胞因子體外大量誘導樹突狀細胞擴增是獲 取研宄所需樹突狀細胞的最佳途徑。IL-4和GM-CSF兩種細胞因子在誘導血液單核細胞和 骨髓細胞成為未成熟的樹突狀細胞中發揮重要作用。利用IL-4和GM-CSF這兩種細胞因子 聯合刺激外周血單核細胞和骨髓液前體細胞，可以誘導培養獲得未成熟的樹突狀細胞。 進行豬樹突狀細胞相關的免疫學研宄，在動物醫學領域意義重大，能為深入研宄 豬傳染病的防止打下了基礎；其次，目前對于樹突狀細胞的研宄主要集中在人和小鼠上，而 豬作為與人極為相似的哺乳動物，在解剖和基因上十分接近于人類，可作為一種更具優勢 的大動物模型，是免疫學和病原微生物與宿主研宄的理想對象；此外，豬作為最理想的異種 器官移植供體動物，其樹突狀細胞在異種移植排斥反應及誘導免疫耐受中的作用越來越引 起人們的關注。 IL-4和GM-CSF具有種屬特異性，本研宄提供了一種可以成功在真核細胞表達系 中分別獲得豬的IL-4和GM-CSF重組蛋白的方法，并建立了一種在體外大量制備豬樹突狀 細胞的方法，為深入研宄豬的樹突狀細胞的各項功能以及與各種病原微生物作用等研宄奠 定基礎。 三、
技術實現思路
技術問題 本專利技術提供了一種高效制備IL-4和一種高效制備GM-CSF重組蛋白的方法。可聯 合應用上述兩種重組蛋白刺激豬外周血單核細胞和骨髓液前體細胞，體外誘導培養獲得豬 樹突狀細胞。這一生物學應用成本低，誘導細胞純度高，具有良好應用前景和使用價值。 技術方案 本專利技術設計兩種重組蛋白IL-4和GM-CSF，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO :1和 SEQ ID N0:2。以及兩種監測目的重組蛋白表達情況的融合重組蛋白IL-4-G和GM-CSF-G， 其核苷酸序列分別為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。 A、從豬的總CDNA中擴增出擴增獲得帶有kozak序列、IL-4基因的CDS區和His6 標簽（可串聯綠色熒光蛋白基因）的序列片段，用in-fusion同源重組技術拼接到去除 AcGFPl基因的pLVX-AcGFPl-Nl載體的克隆位點中構建重組質粒； B、從豬的總CDNA中擴增出擴增獲得帶有kozak序列、IL-4信號肽基因、GM-CSF成 熟肽基因、His6標簽（可串聯綠色熒光蛋白基因）的序列片段，用in-fusion同源重組技術 拼接到去除AcGFPl基因的pLVX-AcGFPl-Nl載體的克隆位點中構建重組質粒； C、重組質粒轉染HEK-293細胞進行重組蛋白的分泌表達。 在一個實施例中，經驗證GM-CSF使用自身的信號肽序列表達效率較低，提高表達 效率，兩種目的蛋白IL-4和GM-CSF均使用IL-4的信號肽，具有可行性，再通過合適的表達 系統進行蛋白表達，整個過程涉及到基因分子克隆重組、蛋白表達技術，所用技術方法均合 乎該領域適合的技術方法。 在一個實施例中，將目的蛋白IL-4和GM-CSF于綠色熒光蛋白ZsGreenl進行融合 表達作為對照，可對目的蛋白表達情況進行監督控制。 在一個實施例中，由于GM-CSF和IL-4屬于外源重組蛋白，選擇HEK-293細胞作為 表達系統適合外源蛋白的表達，能提高重組蛋白的成功率和表達量，便于后續蛋白純化。目 的蛋白帶有His 6標簽，可通過Ni磁珠進行純化。 本專利技術還提供一種體外制備豬樹突狀細胞的方法，其特征在于用上述兩種重組蛋 白體外刺激誘導豬外周血單核細胞和骨髓液前體細胞，從而產生大量高純度的豬樹突狀細 胞。 本專利技術方法簡單，易操作，成本低，誘導細胞純度高，具有良好應用前景和使用價 值。 有益效果 本專利技術表達的兩種重組蛋白可聯合使用于體外制備豬骨髓源和外周血源樹突狀 細胞。經形態學觀察、免疫熒光和流式細胞術鑒定、吞噬功能驗證，為高純度的未成熟樹突 狀細胞，可用于免疫學基礎研宄。 本專利技術表達的兩種重組蛋白還可用作其他用途，如疫苗免疫增強劑。 四、【附圖說明】 圖1 :構建的重組型表達質粒pLVX-S-IL-4示意圖 圖2 :構建的重組型表達質粒pLVX-S-GM-CSF示意圖 圖3 :構建的重組型表達質粒pLVX-S-IL-4-G示意圖 圖4 :構建的重組型表達質粒pLVX-S-GM-CSF-G示意圖 圖 5 :重組型表達質粒 pLVX-S-IL-4-G、pLVX-S-GM-CSF-G 瞬時轉染 HEK-293 細胞 48h熒光蛋白表達情況 圖6 :利用重組蛋白制備的豬骨髓源樹突狀細胞細胞形態學觀察 圖7 :利用重組蛋白制備的豬骨髓源樹突狀細胞免疫熒光觀察 圖8 :流式細胞術鑒定利用重組蛋白制備的豬骨髓源樹突狀細胞表型 圖9 :利用重組蛋白制備的豬骨髓源樹突狀細胞吞噬功能驗證 圖10 :利用重組蛋白制備的豬外周血源樹突狀細胞細胞形態學觀察 圖11 :流式細胞術鑒定利用重組蛋白制備的豬外周血源樹突狀細胞表型 五、【具體實施方式】【具體實施方式】 為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，對本專利技術進行進一步詳細 說明。本申請中的方法若無特殊說明，都是本領域常規方法。具體涉及的材料和試劑如下： E. coli JM109 購自 Takara 公司、質粒 pLVX-AcGFPl-Nl 和 pLVX-shRNA2 購自 Clontech公司、pCDNA3. 1購自Life Technologies公司；HEK-293細胞為南京農業大學動 物醫學院組織胚胎學實驗室提供。 試劑：TRizol、反轉錄試劑盒購自Takara公司；Q5高保真酶購自NEB公司； Agarose Gel DNA Purification Kit，限制性內切酶購自Thermo公司；DNA純化試劑盒、無 內毒素質粒提取試劑盒等均購自OMEGA公司；ClonExpress II重組克隆試劑盒購自Vazyme 公司；脂質體X_tremeGENE HP DNA購自Roche公司、培養基DMEM、胎牛血清購自Invitrogen 公司；豬源GM-CSF和豬源IL-4購自以色列ProSpec公司；PE標記小鼠抗豬⑶Ia單抗購 自Abcam公司；FITC標記小鼠抗豬SLA-II-DR單抗購自Lifespan公司；PE標記小鼠抗豬 SWC3a單抗購自BD公司；FITC標記的葡聚糖購自Sigma公司。其他試劑均為國產或進口分 析純級。 實施例1. pLVX-S-IL-4、pLVX-S-GM-CSF重組表達載體的構建 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種高效制備豬IL?4重組蛋白的方法，其特征在于該方法由以下步驟組成：通過PCR擴增獲得帶有kozak序列、IL?4基因的CDS區和His6標簽的序列，用in?fusion同源重組技術拼接到去除AcGFP1基因的pLVX?AcGFP1?N1載體的克隆位點中構建重組質粒；重組質粒轉染哺乳動物細胞進行重組蛋白的分泌表達。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊倩，涂沖智，朱立麒，林建，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32