結合EGFR和C-MET III型纖連蛋白域的分子制造技術

本發明專利技術公開了包含EGFR和/或c-Met?FN3域的單特異性和雙特異性分子、編碼所述分子的分離的多核苷酸、載體、宿主細胞，以及它們的制備方法。這些包含EGFR和/或c-Met?FN3域的單特異性和雙特異性分子可用于生成用于治療和診斷包括癌癥的病癥和疾病的治療組合物。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】結合EGFR和C-METIII型纖連蛋白域的分子
本專利技術涉及結合EGFR和/或c-Met的單特異性或雙特異性分子以及制備和使用該分子的方法。
技術介紹
表皮生長因子受體(EGFR、ErbB1或HER1)是由c-erbB1原癌基因編碼的170kDa跨膜糖蛋白。EGFR是受體酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生長因子受體(HER)家族的成員，所述家族包括HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。EGFR信號傳導通過如下方式引發：配體結合、之后誘導構象變化、受體與其他ErbB家族成員的同源二聚化或異源二聚化，以及受體的反式自磷酸化(Ferguson等人，AnnuRevBiophys，37：353-73，2008)，這引發了信號轉導級聯，最終影響多種多樣的細胞功能，包括細胞增殖和存活。EGFR的表達或激酶活性的增加與一系列人癌癥有關，從而使EGFR成為治療干預的有吸引力的靶標(Mendelsohn等人，Oncogene19：6550-6565，2000；Grünwald等人，JNatlCancerInst，95：851-67，2003；Mendelsohn等人，SeminOncol，33：369-85，2006)。在非小細胞肺癌中，EGFR基因拷貝數和蛋白表達兩者的增加與對EGFR酪氨酸激酶抑制劑IRESSATM((吉非替尼)的有利響應相關聯(Hirsch等人，AnnOncol18：752-60，2007)。EGFR療法包括小分子和抗EGFR抗體兩者，它們經批準用于治療結腸直腸癌、胰腺癌、頭頸癌和非小細胞肺癌(NSCLC)(Baselga和Arteaga，JClinOncol，23：2445-2459(20005；Gill等人，JBiolChem，259：7755-7760，1984；Goldstein等人，ClinCancerRes，1：1311-1318，1995；Prewett等人，ClinCancerRes，4：2957-2966，1998)。抗EGFR療法的療效可取決于瘤類型以及瘤中的EFGR突變/擴增狀態。當前療法的副作用可包括皮膚毒性(DeRoock等人，LancetOncol11：753-762，2010；Linardou等人，NatRevClinOncol，6：352-366，2009；Li和Perez-Soler，TargOncol4：107-119，2009)。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)通常用作非小細胞肺癌(NSCLC)的二線療法，但由于抗藥途徑的原因，通常會在十二個月內失效(Riely等人，ClinCancerRes12：839-44，2006)。c-Met編碼酪氨酸激酶受體。其在1984年在發現用致癌物處理產生了組成型活性融合蛋白TPR-MET之后，首次被鑒定為原癌基因(Cooper等人，Nature，311：29-33，1984)。c-Met被其配體肝細胞生長因子(HGF)激活會刺激大量的細胞過程，包括生長、運動、侵襲、轉移、上皮細胞-細胞轉化、血管生成/創傷愈合以及組織再生(Christensen等人，CancerLett225：1-26，2005；Peters和Adjei，NatRevClinOncol，9：314-26，2012)。c-Met被合成為單鏈蛋白質，該蛋白質被蛋白水解裂解成由二硫鍵連接的50kDaα-亞基和140kDaβ-亞基(Ma等人，CancerandMetastasisReviews，22：309-325，2003)。c-Met在結構上類似于其他膜受體諸如Ron和。HGF：c-Met結合的準確化學計量尚不清楚，但通常認為兩個HGF分子結合于兩個c-Met分子，導致受體二聚化以及在1230、1234和1235位酪氨酸處自磷酸化(Stamos等人，TheEMBOJournal，23：2325-2335，2004)。非配體依賴性c-Met自磷酸化也可由于基因擴增、突變或受體過表達而發生。c-Met在多種類型的癌(包括胃癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌和CNS癌)中常常被擴增、突變或過表達。通常定位于激酶域的錯義突變常見于遺傳性乳頭狀腎細胞癌(PRCC)和13％的散發性PRCC(Schmidt等人，Oncogene18：2343-2350，1999)。定位于c-Met的臂板蛋白或近膜域的c-Met突變常見于胃癌、頭頸癌、肝癌、卵巢癌、NSCLC和甲狀腺癌(Ma等人，CancerandMetastasisReviews，22：309-325，2003；Sakakura等人，ChromosomesandCancer，1999，24：299-305)。已在腦癌、結腸直腸癌、胃癌和肺癌中檢測到c-Met擴增，這通常與疾病進展相關(Ma等人，CancerandMetastasisReviews，22：309-325，2003)。分別多至4％和20％的非小細胞肺癌(NSCLC)和胃癌表現出c-Met擴增(Sakakura等人，ChromosomesandCancer，1999，24：299-305；Sierra和Tsao，TherapeuticAdvancesinMedicalOncology，3：S21-35，2011)。甚至在不存在基因擴增的情況下，通常在肺癌中觀察到c-Met過表達(Ichimura等人，JpnJCancerRes，87：1063-9，1996)。此外，在臨床樣品中，將近一半的肺腺癌表現出高水平的c-Met和HGF，這兩者均與增強的瘤生長速率、轉移和不良預后相關(Sierra和Tsao，TherapeuticAdvancesinMedicalOncology，3：S21-35，2011；Siegfried等人，AnnThoracSurg66：1915-8，1998)。抵抗EGFR酪氨酸激酶抑制劑的所有瘤中的將近60％增加c-Met表達、擴增c-Met或增加其唯一已知配體HGF(Turke等人，CancerCell，17：77-88，2010)，表明存在通過c-Met對EGFR的補償途徑。在抵抗吉非替尼(一種EGFR激酶抑制劑)并經Her3途徑表現出增強存活率的培養細胞中，c-Met擴增被首次鑒定(Engelman等人，Science，316：1039-43，2007)。這進一步在臨床樣品中得到驗證，其中具有對厄洛替尼或吉非替尼的獲得性抗性的43名患者中有9名表現出c-Met擴增，與之相比的是，62名未治療患者中僅兩名有此表現。九名治療患者中有四名也獲得了EGFR激活突變T790M，證實為同步抗性途徑(Beat等人，ProcNatlAcadSciUSA，104：20932-7，2007)。EGFR和c-Met在癌中的單獨作用已充分確立，使得這些靶標對于聯合療法具有吸引力。兩個受體均通過相同的存活和抗凋亡途徑(ERK和AKT)傳導信號；因此，聯合抑制該對受體可限制補償途徑激活的可能性，從而改善總體療效。在(厄洛替尼)與NSCL的抗c-Met單價抗體聯用(Spigel等人，2011ASCOAnnualMeetingProceedings，2011，JournalofCl本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種分離的包含FN3域的雙特異性分子，其包含第一III型纖連蛋白(FN3)域和第二FN3域，其中所述第一FN3域特異性地結合表皮生長因子受體(EGFR)并阻礙表皮生長因子(EGF)結合于EGFR，并且所述第二FN3域特異性地結合肝細胞生長因子受體(c?Met)并阻礙肝細胞生長因子(HGF)結合于c?Met。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.11.21 US 61/728906;2012.11.21 US 61/728914;201.一種分離的包含FN3域的雙特異性分子，其包含第一III型纖連蛋白(FN3)域和第二FN3域，其中所述第一FN3域特異性地結合表皮生長因子受體(EGFR)并阻礙表皮生長因子(EGF)結合于EGFR，并且所述第二FN3域特異性地結合肝細胞生長因子受體(c-Met)并阻礙肝細胞生長因子(HGF)結合于c-Met，其中所述第一FN3域和所述第二FN3域包含以下的氨基酸序列：a)分別SEQIDNO:27和32；b)分別SEQIDNO:27和40；或c)分別SEQIDNO:107和41。2.根據權利要求1所述的雙特異性分子，其中所述第一FN3域和所述第二FN3域通過接頭偶聯。3.根據權利要求2所述的雙特異性分子，其中...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M安德森，R阿特塔，M迪伊姆，L原，S賈科布斯，A金，D克萊恩，S莫雷斯，K奧內爾，K皮查，
申請(專利權)人：詹森生物科技公司，
類型：發明
國別省市：美國;US