一種缺齒蓑蘚ISSR?PCR分子標記方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種缺齒蓑蘚ISSR?PCR分子標記方法，包括以下步驟：1)提取缺齒蓑蘚的基因組DNA，2)進行ISSR?PCR擴增；步驟2)進行ISSR?PCR擴增的反應體系為：30μL反應體系中含有10×LAPCR緩沖液3μL，模板DNA50ng，Mg

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及分子生物學領(lǐng)域，尤其是涉及一種缺齒蓑蘚ISSR-PCR分子標記方法。
技術(shù)介紹
木靈蘚科(Orthotrichaceae)蓑蘚屬(Macromitrium?Bridel)是泛熱帶分布的類群。中國的蓑蘚屬植物種類非常豐富，缺齒蓑蘚(Macromitrium?gymnostomum)是其中的一大種類，因蒴帽無齒故名為缺齒蓑蘚，該種主要特點是主莖匍匐蔓生，密生紅棕色假根；枝條直立，單一或有數(shù)個小短枝，長達5.0mm。葉片中部細胞透明，長方形，厚壁，平滑；上部細胞略不透明，圓形，具不明顯的疣。枝葉干燥時卷曲，濕潤時線形，線狀披針形或卵狀披針形，孢蒴直立，橢圓狀圓柱形，具有皺縮，蒴齒缺失。蒴帽兜形，長1.7-2.0mm，偶爾長僅1.5mm，基部很寬，多少分裂和具皺褶，無毛。具有棕紅色的由4-10個細胞組成的條狀無性芽胞。Sullivant,William?Starling于1859年在Proceedings?of?the?American?Academy?of?Arts?and?Sciences首次發(fā)表該種的命名文章。苔蘚植物是植物界的拓荒者之一，在植物界系統(tǒng)演化過程中具有特殊的地位。苔蘚植物作為生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，對巖石風化、土壤有機質(zhì)積累、森林沼澤化等具有重要的生態(tài)學功能，而且其在環(huán)境保護、藥用、園藝等領(lǐng)域以及在生態(tài)學、植物化學、細胞遺傳學等學科中的科研價值也日益受到關(guān)注。隨著DNA分子標記技術(shù)的發(fā)展，人們已將這一技術(shù)廣泛的應用于種類的鑒定、多樣性分析等方面。目前DNA分子標記技術(shù)已發(fā)展到十余種，常用手段包括RAPD、ISSR、AFLP、SRAP等。ISSR(inter-simple?sequence?repeat,簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性)是由加拿大Zietkiewicz等提出的，其原理是利用錨定的微衛(wèi)星為引物，擴增間隔不是很大的兩個SSR間的序列，再通過凝膠電泳條帶分析樣本DNA多態(tài)性。ISSR分子技術(shù)的優(yōu)點是無需預先知道基因組的任何信息就可以進行標記，可以在生長周期的任何階段進行檢測，而且引物設計容易，成本低，DNA用量少，因此被認為是一種比較理想的分子標記方法。ISSR分子標記技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應用于許多被子植物的遺傳多樣性分析中，但對于苔蘚植物的研究不是很多，僅見Skotnicki對黃瓜絲蘚、劉麗等對鼠尾蘚以及李倩影對小羽蘚屬的遺傳多樣性的研究，對于ISSR標記法使用較少，國內(nèi)見于汪琛穎等對狹葉大邊蘚、真蘚科以及王瑩瑩對浙江千島湖大灰蘚、東亞小金發(fā)蘚遺傳多樣性的研究。因此，對缺齒蓑蘚的研究和其他的種類比較還有差距，建立一個相對科學合理有效的ISSR-PCR反應體系，探尋最佳的處理組合，可以為后續(xù)的科學研究提供很好的技術(shù)指導和理論支持。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的就是為了提供一種缺齒蓑蘚ISSR-PCR分子標記方法，以填補現(xiàn)有技術(shù)的空白。本專利技術(shù)的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種缺齒蓑蘚ISSR-PCR分子標記方法，包括以下步驟：1)提取缺齒蓑蘚的基因組DNA；2)進行ISSR-PCR擴增。步驟2)進行ISSR-PCR擴增的反應體系為：30μL反應體系中含有10×LA?PCR緩沖液3μL，模板DNA50ng，Mg2+為1.5mmol/L，dNTP為0.25mmol/L，Taq酶為1.5U，引物為0.5μmol/L。所述的引物選自SEQ?ID?No.1～10中的任一條，具體如下表所示：步驟2)進行ISSR-PCR擴增的條件為：94℃退火4min，然后94℃45S、53℃45S、72℃1min?40個循環(huán)，最后72℃延伸10min。步驟2)進行ISSR-PCR擴增的循環(huán)數(shù)為25-45，優(yōu)選為40。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)所建立的缺齒蓑蘚ISSR-PCR反應體系擴增出的條帶穩(wěn)定性高，清晰度高，具有很高的多態(tài)性的特點。彌補了國內(nèi)對缺齒蓑蘚遺傳多樣性研究的不足，專利技術(shù)的成果可用于缺齒蓑蘚遺傳關(guān)系、分子標記以及生物地理學方面的研究具有很大的科學價值和應用價值。附圖說明圖1為ISSR-PCR探索性正交試驗設計反應體系的擴增結(jié)果；M表示：DL2000Marker；引物為UBC834；1-9為表3的處理組合1-9；圖2為ISSR-PCR細調(diào)性正交試驗圖；M表示：DL2000Marker；引物UBC834；1-9為表3的處理組合1-9圖3為篩選出的適合缺齒蓑蘚ISSR擴增的引物擴增結(jié)果；M表示：DL2000Marker；1,2.UBC807；3,4.UBC810；5,6.UBC?811；7,8.UBC?808；9,10.UBC?834；11,12.UBC?835；13,14.UBC889；15,16.UBC?880；17,18.UBC?890；19,20.UBC?826；21,22.UBC?842；23,24.UBC?856.圖4為ISSR-PCR反應體系中不同循環(huán)次數(shù)的擴增結(jié)果；1-4分別為循環(huán)數(shù)目25個、30個、35個、40個和45個；M表示：DL2000；引物為UBC834。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本專利技術(shù)進行詳細說明。實施例1提取缺齒蓑蘚基因組DNA。實施例2擴增體系的篩選以及優(yōu)化1、探索性ISSR-PCR反應體系的正交試驗設計正交優(yōu)化設計篩選ISSR的最優(yōu)反應體系(四因素三水平)，選用L9(34)正交表，設計PCR擴增體系各成分的因素-水平正交設計實驗表(方案見表2及表3)。以UBC834為引物，利用表3中的9個體系，對缺齒蓑蘚基因組DNA進行ISSR擴增。反應體系為30μL，除表中所列因素外，每管含有10×LA?PCR?buffer?3μL，DNA模板50ng。擴增程序為：94℃退火4min，然后94℃45S、53℃45S、72℃1min40個循環(huán)，最后72℃延伸10min，10℃°保存。表1?ISSR擴增的引物和序列表2探索性ISSR-PCR反應體系的正交試驗設計[L9(34)]單位：μL探索性正交試驗結(jié)果見圖1，1號，8號沒有擴增出條帶，2號，3號，4號，5號處理有微弱的條帶，7號條帶有但是清晰度不高，6號和9號處理的條帶多重復性好，說明了距最優(yōu)組合偏差不大，我們以此為基點，縮小各個因素的濃度梯度進行細調(diào)性正交試驗。2、細調(diào)性ISSR-PCR反應體系的建立細調(diào)性ISSR-PCR反應體系的正交試驗設計見表3.表3細調(diào)性ISSR-PCR反應體系的正交試驗設計細調(diào)性正交試驗結(jié)果見圖2，除本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種缺齒蓑蘚ISSR?PCR分子標記方法，其特征在于，包括以下步驟：1)提取缺齒蓑蘚的基因組DNA；2)進行ISSR?PCR擴增。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種缺齒蓑蘚ISSR-PCR分子標記方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)提取缺齒蓑蘚的基因組DNA；
2)進行ISSR-PCR擴增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種缺齒蓑蘚ISSR-PCR分子標記方法，其特征在
于，步驟2)進行ISSR-PCR擴增的反應體系為：30μL反應體系中含有10×LA?PCR
緩沖液3μL，模板DNA50ng，Mg2+為1.5mmol/L，dNTP為0.25mmol/L，Taq酶
為1.5U，引物為0.5μmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種缺齒蓑蘚ISSR-PCR分子標記方法，其特征在
于，所述的引物選自SEQ?ID?No...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉小慧，詹玲，陳云輝，劉曄彤，鄒滿鈺，蔡錦蓉，吳倩倩，郭水良，
申請(專利權(quán))人：上海師范大學，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31