一種浴場海水中致病性細(xì)菌的基因芯片檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于環(huán)境檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種浴場海水中致病性細(xì)菌的基因芯片檢測方法，用于同時檢測浴場海水中主要的致病性細(xì)菌。本發(fā)明專利技術(shù)是根據(jù)其特異性靶基因設(shè)計特異性的引物和探針，通過熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物，制備氨基芯片，雜交，清洗、掃描等步驟實現(xiàn)對致病性細(xì)菌高通量、快速檢測的目的，此外，還對其探針濃度、Cy3隨機引物濃度、芯片紫外交聯(lián)時間進(jìn)行了優(yōu)化。本發(fā)明專利技術(shù)可在短時間內(nèi)全面掌握海水浴場的環(huán)境現(xiàn)狀與變化趨勢，可以實現(xiàn)浴場海水中致病性細(xì)菌的靈敏、準(zhǔn)確、高效檢測。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于環(huán)境檢測
，涉及一種浴場海水中致病性細(xì)菌的基因芯片檢測方法。
技術(shù)介紹
夏秋時節(jié)旅游旺季海濱浴場承受著超負(fù)荷的壓力，給浴場水質(zhì)帶來了嚴(yán)重的影響，同時也增加了病原微生物的傳播機會。細(xì)菌是引發(fā)感染性疾病的主要病原體，在抗生素濫用的選擇壓力下，海洋環(huán)境中出現(xiàn)了大量的耐藥細(xì)菌，給人類健康帶來了潛在且無法估計的新威脅，因此，多種致病性細(xì)菌的同時、快速、靈敏、特異的診斷是有效預(yù)防感染性疾病發(fā)生，控制其暴發(fā)性傳播的前提和關(guān)鍵。雖然PCR及其衍生技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)致病性細(xì)菌的快速、靈敏診斷，但是一次只能同時檢測一種致病性細(xì)菌，與之相比，基因芯片技術(shù)具有高通量、平行性、微型化、自動化等顯著優(yōu)點，該技術(shù)的出現(xiàn)為致病性細(xì)菌的分子診斷提供了有力的技術(shù)支撐。目前國內(nèi)外許多學(xué)者都已經(jīng)將基因芯片技術(shù)應(yīng)用到臨床以及食品安全等多個研究領(lǐng)域。我國自1997年開始了解生物芯片技術(shù)，1998年正式進(jìn)入芯片研究，現(xiàn)全國已有20多家科研機構(gòu)和公司從事生物芯片的研發(fā)。目前與致病性細(xì)菌檢測相關(guān)的基因芯片研究獲得長足進(jìn)展，已申請的專利包括“食源性致病菌快速檢測基因芯片及其應(yīng)用”、“炭疽菌診斷基因芯片的制備及應(yīng)用”、“泌尿生殖道炎癥病原體和耐藥性集成診斷基因芯片及方法”等上百種。然而由于海水中雜質(zhì)較多、致病性細(xì)菌種類繁多，且檢測靶位易突變，給該方法的應(yīng)用帶來一系列困難，造成該方法尚未在海洋環(huán)境檢測領(lǐng)域得以應(yīng)用。目前，基因芯片對應(yīng)的探針靶定區(qū)域通常選擇致病性細(xì)菌的16S?rDNA序列、23S?rRNA序列和16S?rRNA-23S?rRNA基因。16S?rDNA序列因具有高度保守性，已成為細(xì)菌種屬鑒定最常用的序列，但由于其高度保守性，因而不能很好的鑒別相近種或同一種內(nèi)的不同菌株；而23S?rRNA序列目前被報道的比較少，我們常常無法獲取需要的序列；16Sr?RNA-23Sr?RNA基因區(qū)間由于其可用于鑒別相近種，或同一種內(nèi)的差異，而被廣泛應(yīng)用，但對于只有一個或兩個操縱子拷貝的細(xì)菌而言，不能利用16S?rRNA-23S?rRNA的基因區(qū)間序列進(jìn)行探針的設(shè)計，因此，為保證其特異性，需要選擇合適的特異性的靶基因進(jìn)行引物設(shè)計。目前基因芯片對應(yīng)的探針種類主要有兩種，一種是進(jìn)行氨基修飾的長度在20-40mer的探針，另一種是不進(jìn)行氨基修飾的60-70mer的探針。以往的研究多采用的是短探針。短探針可用來檢測單個堿基的不同，提高檢測的特異性，需點制在醛基基片上；而長探針不需要檢測到單個堿基的差異，當(dāng)考慮到不同個體之間的核酸堿基多態(tài)性時，可選擇設(shè)計此類探針，該類探針需點制在氨基基片上。與短探針相比，長探針具有更好的特異性和均一的退火溫度(Tm值)，被證明在靈敏度和特異度兩方面表現(xiàn)更佳，此外還能兼顧信號強度，但是以往的?研究多采用短探針。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)以浴場海水中對人類危害較大的6種致病性細(xì)菌為研究對象，旨在建立浴場海水致病性細(xì)菌的基因芯片檢測方法，科學(xué)合理的確定其反應(yīng)條件的最優(yōu)化，并克服海水環(huán)境復(fù)雜的缺點，保證檢測的特異性。建立其基因芯片的檢測方法。本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案是：一種浴場海水中致病性細(xì)菌的基因芯片檢測方法，該檢測方法的步驟為：第一步：致病性細(xì)菌及其靶基因的確定。根據(jù)國內(nèi)外大量的文獻(xiàn)報道以及本研究前期大量的調(diào)查研究為基礎(chǔ)，確立了浴場海水中常見的、對人類危害較大的6種致病性細(xì)菌，分別為嗜水氣單胞菌、大腸桿菌O157:H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌。根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)確定上述各菌株的特異性靶基因。其特異性靶基因分別為：嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)的AhaI基因、大腸桿菌O157：H7(E.coliO157:H7)的hlyA、fliC、rfbE基因、腸炎沙門氏菌(Salmonella)的invA和hilA基因、單增李斯特菌(L.monocytogenes)的plc和hlyA基因、溶藻弧菌(V.alginolyticus)的hsp60基因、金黃色葡萄球菌(S.aureus)的tuf基因。第二步：6種浴場致病性細(xì)菌70-mer寡核苷酸探針及引物的設(shè)計。應(yīng)用AlleleID?6.0軟件設(shè)計特異基因的引物及寡核苷酸探針，并應(yīng)用DNASTAR軟件對其進(jìn)行評價。引物和探針信息如表1和表2所示。表1各致病性細(xì)菌的引物序列及其Tm值表2各致病性細(xì)菌的探針序列及其Tm值第三步：熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物。PCR擴增采用20μL反應(yīng)體系，1)取5μL?PCR產(chǎn)物至無菌潔凈的0.2mL離心管中，作為模板；2)向每個樣品管加入一定濃度的帶有熒光素Cy3標(biāo)記的隨機引物(9N)溶液3μL，并補水至19μL，震蕩混勻，瞬時離心。在最佳探針濃度和最佳基因組濃度條件下，進(jìn)行Cy3-隨機引物濃度的確定，當(dāng)Cy3-隨機引物濃度為0.375μM時，能產(chǎn)生肉眼可見的熒光。而當(dāng)Cy3-隨機引物濃度為0.190μM時，熒光度值＜1000，產(chǎn)生的熒光極弱，說明Cy3-隨機引物的最低濃度至少可達(dá)到0.375μM，為確保能產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號，本實驗過程中采用的Cy3-隨機引物濃度為0.75μM；3)將離心后的樣品管放入PCR儀，95℃變性3min，立即放置冰上3min；4)在冰上制備熒光標(biāo)記反應(yīng)體系Mix：5×Klenow?Buffer?2.5μL，klenow酶1μL，dNTP(2.5mM)2.5μL；5)將步驟3)樣品管瞬時離心，并向各管中加入6μL熒光標(biāo)記反應(yīng)體系Mix，震蕩混勻，瞬時離心；6)將離心管放入PCR儀，進(jìn)行熒光標(biāo)記擴增，熒光標(biāo)記反應(yīng)程序為：37℃?1.5h，70℃?10min。7)程序結(jié)束后，將樣品置于冰上，然后進(jìn)行芯片雜交。為確定最佳的紫?外交聯(lián)時間，在紫外照射能量為2400mJ條件下，分別照射0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h，紫外交聯(lián)1h時，即可產(chǎn)生肉眼可見的熒光信號，熒光信號值為5808，而交聯(lián)0.5h時，熒光值為＜1000。因此確定當(dāng)紫外照射能量為2400mJ時，最低紫外交聯(lián)時間為1h，為確保實驗的能產(chǎn)生穩(wěn)定熒光信號，本實驗采用的紫外交聯(lián)時間為2h；第四步：制備基因芯片。采用噴點式芯片點樣系統(tǒng)點樣儀，以及Nano-tip?A070-401點樣針進(jìn)行點樣。將一定濃度的探針與點樣液等體積混合，然后用移液槍將其混合物加入384孔板，按照設(shè)定好的參數(shù)將探針點到氨基化玻片上，每個點重復(fù)三次。點樣時要注意保持濕度為70％，點樣時除放芯片之外，還要放一張感應(yīng)試紙(用于觀察點樣效果)。點樣完畢后，將點好的芯片取出，關(guān)閉儀器。將點制好的芯片放入紫外燈下交聯(lián)一定的時間，然后用0.5％的SDS沖洗2min，用離心機甩干后，放入4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^設(shè)置探針濃度梯度，發(fā)現(xiàn)探針濃度為1μM到16μM都可以檢測到熒光信號，而探針濃度為0.5μM時，熒光度值＜500，熒光信號很微弱，因此我們確定探針的最小終濃度為1μM，為確保實驗的經(jīng)濟合理且順利進(jìn)行，實驗過程中我們采用能產(chǎn)生較強穩(wěn)定熒光信號的探針濃度2μM；第五步：雜交。將雜交buffer放到50℃水浴鍋中本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種浴場海水中致病性細(xì)菌的基因芯片檢測方法，其特征在于，該檢測方法的步驟為：第一步：致病性細(xì)菌及其靶基因的確定，確立浴場海水中常見的6種致病性細(xì)菌，分別為嗜水氣單胞菌、大腸桿菌O157:H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌，其靶基因分別為：嗜水氣單胞菌的AhaI基因、大腸桿菌O157：H7的hlyA、fliC、rfbE基因、腸炎沙門氏菌的invA和hilA基因、單增李斯特菌的plc和hlyA基因、溶藻弧菌的hsp60基因、金黃色葡萄球菌的tuf基因；第二步：6種浴場致病性細(xì)菌長度為70?mer寡核苷酸探針及引物的設(shè)計，應(yīng)用AlleleID?6.0軟件設(shè)計特異基因的引物及寡核苷酸探針；第三步：熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物，PCR擴增采用20μL反應(yīng)體系：1)取5μL?PCR產(chǎn)物至無菌潔凈的0.2mL離心管中，作為模板；2)向每個樣品管加入一定濃度的帶有熒光素Cy3標(biāo)記的隨機引物(9N)液3μL，并補水至19μL，震蕩混勻，瞬時離心；3)將離心后的樣品管放入PCR儀，95℃變性3min，立即放置冰上3min；4)在冰上制備熒光標(biāo)記反應(yīng)體系Mix：5×Klenow?Buffer?2.5μL，klenow酶1μL，dNTP(2.5mM)2.5μL；5)將步驟3)樣品管瞬時離心，并向各管中加入6μL熒光標(biāo)記反應(yīng)體系Mix，震蕩混勻，瞬時離心；6)將離心管放入PCR儀，進(jìn)行熒光標(biāo)記擴增，熒光標(biāo)記反應(yīng)程序為：37℃1.5h，70℃10min；7)程序結(jié)束后，將樣品置于冰上，然后進(jìn)行芯片雜交；第四步：制備基因芯片，采用噴點式芯片點樣系統(tǒng)點樣儀，以及Nano?tip?A070?401點樣針進(jìn)行點樣；將一定濃度的探針與點樣液等體積混合，然后用移液槍將其混合物加入384孔板，按照設(shè)定好的參數(shù)將探針點到氨基化玻片上，每個點重復(fù)三次，點樣時要注意保持濕度為70％，點樣時除放芯片之外，還要放一張感應(yīng)試紙，點樣完畢后，將點好的芯片取出，關(guān)閉儀器，將點制好的芯片放入紫外燈下交聯(lián)一定的時間，然后用0.5％的SDS沖洗2min，用離心機甩干后，放入4℃冰箱避光保存?zhèn)溆茫坏谖宀剑弘s交，將雜交buffer放到50℃水浴鍋中預(yù)熱，然后配置20μL的雜交液：4×雜交緩沖液??5μL，熒光標(biāo)記產(chǎn)物??15μL雜交液配好后，95℃變性3min，立即放置冰上，然后放入沸水中煮沸2min后，立即放入預(yù)冷的無水乙醇中1min，用低速離心機將芯片甩，然后將該芯片對應(yīng)的感應(yīng)試紙放于芯片下面，按照感應(yīng)試紙上矩陣的排列方式，避光條件下，用移液槍取15μL的熒光標(biāo)記產(chǎn)物和5μL的陽控混合均勻后加入芯片點樣區(qū)，然后蓋上蓋玻片，然后將此芯片放入65℃水浴鍋中水浴2h；第六步：芯片清洗及掃描。取出上一步的芯片，用自來水沖洗半分鐘，再用蒸餾水沖洗一次，然后分別用42℃預(yù)熱過的洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分別洗脫2min，洗液Ⅰ是用10mL?20×SSC(175.3g氯化鈉，88.2g檸檬酸鈉，加蒸餾水定容至1000mL，pH為7.0)和4mL?10×SDS(10g二十烷基磺酸鈉加入雙蒸水100mL制成)加入186mL蒸餾水混勻制成；洗液Ⅱ是用2mL20×SSC加入198mL蒸餾水混勻制成；洗液Ⅲ是用1mL?20×SSC加入199mL蒸餾水混勻制成，洗脫完畢后，將芯片離心甩干，用生物芯片掃描儀掃描芯片，并輸出熒光值，然后用軟件分析所得數(shù)據(jù)。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種浴場海水中致病性細(xì)菌的基因芯片檢測方法，其特征在于，該檢測方法的步驟為：
第一步：致病性細(xì)菌及其靶基因的確定，確立浴場海水中常見的6種致病性細(xì)菌，分別為嗜
水氣單胞菌、大腸桿菌O157:H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球
菌，其靶基因分別為：嗜水氣單胞菌的AhaI基因、大腸桿菌O157：H7的hlyA、fliC、rfbE
基因、腸炎沙門氏菌的invA和hilA基因、單增李斯特菌的plc和hlyA基因、溶藻弧菌的hsp60
基因、金黃色葡萄球菌的tuf基因；
第二步：6種浴場致病性細(xì)菌長度為70-mer寡核苷酸探針及引物的設(shè)計，應(yīng)用AlleleID?6.0
軟件設(shè)計特異基因的引物及寡核苷酸探針；
第三步：熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物，PCR擴增采用20μL反應(yīng)體系：
1)取5μL?PCR產(chǎn)物至無菌潔凈的0.2mL離心管中，作為模板；
2)向每個樣品管加入一定濃度的帶有熒光素Cy3標(biāo)記的隨機引物(9N)
液3μL，并補水至19μL，震蕩混勻，瞬時離心；
3)將離心后的樣品管放入PCR儀，95℃變性3min，立即放置冰上3min；
4)在冰上制備熒光標(biāo)記反應(yīng)體系Mix：5×Klenow?Buffer?2.5μL，klenow酶1μL，
dNTP(2.5mM)2.5μL；
5)將步驟3)樣品管瞬時離心，并向各管中加入6μL熒光標(biāo)記反應(yīng)體系Mix，震蕩混勻，
瞬時離心；
6)將離心管放入PCR儀，進(jìn)行熒光標(biāo)記擴增，熒光標(biāo)記反應(yīng)程序為：37℃1.5h，70
℃10min；
7)程序結(jié)束后，將樣品置于冰上，然后進(jìn)行芯片雜交；
第四步：制備基因芯片，采用噴點式芯片點樣系統(tǒng)點樣儀，以及Nano-tip?A070-401點樣針
進(jìn)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：樊景鳳，明紅霞，郭建麗，
申請(專利權(quán))人：國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，
類型：發(fā)明
國別省市：遼寧;21