利用人副流感2型病毒載體的疫苗制造技術

本發明專利技術公開一種病毒載體及其制造方法，所述病毒載體是在人副流感2型病毒基因中整合有編碼抗原多肽的基因的病毒載體，所述病毒載體中，抗原多肽以與病毒的結構蛋白質融合的融合蛋白質的形式表達。本發明專利技術的病毒載體中，在病毒顆粒上定量地大量包含抗原肽，能夠高效地將抗原多肽運送至靶細胞。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及可作為用于預防或治療疾病的疫苗使用的RNA病毒載體及滅活疫苗。
技術介紹
副粘病毒科的病毒具有負單鏈RNA作為基因組，已制作出了能夠利用逆向遺傳學 方法高度表達外源基因的載體，認為其具有作為基因治療用載體或基因重組疫苗用載體的 優異特性。由于病毒的生命周期不包含DNA期（DNA phase)，并且轉錄?復制全部在處于核 外的細胞質中進行，因此，與染色體DNA發生同源性重組的概率極小，由于對染色體的基因 重組而致癌的風險小。 目前為止，本申請的專利技術人試圖將人副流感2型病毒（其為負單鏈RNA病毒，屬于 副粘病毒科副粘病毒亞科聰腺炎病毒（Rubulavirus)屬，下文記作hPIV2)載體化，研宄了 其作為疫苗及基因治療用載體的應用。 在研宄過程中，構建了 F基因（病毒的結構蛋白質）完全缺失了的、hPIV2 的F基因缺失型載體。該載體具有非傳播性（non-transmissible)或單輪感染性 (single-round-infectious)的特性。此外，還成功獲得了具有高效價（high titer)的 載體產生能力的穩定表達F基因的包裝細胞，該細胞可用于F基因缺失型載體的生產。缺 失F基因的該載體，僅能在表達有F基因的包裝細胞中產生將F蛋白質保持于病毒被膜 上的感染性載體。另一方面，在不表達F基因的細胞?組織中，盡管發生所謂的自身復制 (self-replication)，但不能產生感染性的載體，因此，載體不會在受體中無窮盡地增殖， 可以認為其安全性較高（專利文獻1)。 已報道了許多使用基因重組RNA活病毒載體或弱毒化RNA重組病毒的疫苗或基 因治療在非臨床試驗、臨床研宄、臨床試驗等中顯示出有效性的結果（非專利文獻1~9)。 但是，目前還沒有報道被美國食品藥品監督管理局及歐州藥品廳批準為藥品的基因重組活 (live) RNA病毒載體制劑。推測其理由為：使用基因重組的活RNA病毒作為載體時，雖然采 取了利用弱毒化病毒以降低病原性、或利用非傳播型載體等安全層面上的對策，但在感染 細胞內仍大量產生病毒及外源基因產物，因此不能徹底消除對恒常性（homeostasis)的影 響或外源基因的突變等的憂慮。 因此，可以說將基因組滅活或分解為組分（component)從而使病毒不進行轉 錄?復制的疫苗的安全性較高。滅活疫苗的制作多采用使用福爾馬林的處理方法。 但是，被認為安全性較高的滅活疫苗也存在安全性上的問題。20世紀60年代開發 出了針對屬于副粘病毒科的RSV的、利用福爾馬林獲得的滅活RSV疫苗，接種該疫苗后，由 于RSV的自然感染，導致嬰幼兒中出現了重癥患者和2名死亡者。之后全力進行了對其原因 的闡明。發現了利用福爾馬林對病毒進行滅活處理導致F膜蛋白質的立體結構發生變化。 發現：通過接種該疫苗，產生的是不具有對改性后的F膜蛋白質的中和活性的抗體，而由于 經過福爾馬林處理而不存在正常結構的F膜蛋白質，卻沒有產生對該蛋白質具有中和活性 的抗體。并且，認為在接種該疫苗后，由于RSV病毒的自然感染，使得機體反應欲要抑制病 毒的增殖時，將過量產生沒有中和活性的抗體。結果，在通常的RSV感染中觀察不到的那樣 多數的嗜酸性粒細胞浸潤至肺組織，隨之IL-4、IL-5等細胞因子升高，也不能誘導局部IgA 抗體、細胞免疫，從而引起了重癥化。 此外，已知福爾馬林滅活RSV使樹突狀細胞（其為抗原呈遞細胞）成熟的能力比 活RSV差，故研宄了利用不使用福爾馬林的UV處理、熱處理等進行的滅活，但無論采用哪種 處理，將樹突狀細胞活化的能力均較低，并且還誘導炎癥反應，因此未實現實用化。同樣地， 對于屬于副粘病毒科的麻瘆病毒的福爾馬林滅活疫苗，也報道了嗜酸性粒細胞的浸潤和異 型麻瘆。 另一方面，有報道稱在動物試驗中設法使其能夠誘導Thl型免疫的滅活RSV疫苗 具有能預防病毒感染的效果，認為能誘導Thl的滅活疫苗具有可解決上述問題的可能性。 雖然認為由病毒載體引起的導入基因在體內的表達較高，但報道了病毒感染細 胞?組織中的導入基因的表達沒有定量性或表達量低、作為基因治療用載體的實效性不高 的例子。此外，還報道了先前存在的抗體對導入的病毒載體的表達的抑制或伴隨多次的病 毒載體施予而發生的抗體對該載體的表達的抑制。在需要基因表達達到某一定量以上（即 使僅為暫時達到）的基因治療中使用抗體誘導能力高的病毒載體的困難程度從這些報道 例可見一斑。 向病毒載體中導入外源基因并使其表達時，由于外源基因產物不具有包裝信號， 因此外源基因產物通常不被包含于載體中，病毒載體在體內施予后感染受體細胞，由此發 生轉錄?復制，才能產生外源基因產物。因此，病毒載體的感染、轉錄?復制等被中和抗體 等阻礙時，外源基因的表達將被抑制或降低。 此外，在體內，病毒對細胞?組織的感染效率低，或者病毒即使感染也不發生轉錄 復制或效率非常差、外源基因幾乎不表達的情況也很多。認為其原因是：在體內的感染細胞 中，病毒的轉錄復制被由病毒感染誘導的干擾素等抑制為較低水平，細胞外基質等使得病 毒載體無法到達靶細胞，等等。 現有技術文獻 專利文獻專利文獻 1 :W02012/108195 非專利文獻非專利文獻 1 :Vitology. 377 (2)，225 (2008)非專利文獻 2 :Virology. 362 (1)，139 (2007)非專利文獻 3 :Vitology. 16(11)，21883(2008)非專利文獻 4 :Vaccine. 28, 2771，（2010)非專利文獻 5:JVirol. 6521，（2011)非專利文獻 6:JVirol. 1089,（2002)非專利文獻 7 :Vaccine. 29, 8557,（2011)非專利文獻 8:JVirol. 584,（2009)非專利文獻 9:VetImmunolImmunopathol. 146 (1), 92 (2012)
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供能夠高效地向靶細胞中導入抗原多肽（包括蛋白質和肽） 的病毒載體及滅活載體，其是作為預防或治療疾病用的疫苗有用的副粘病毒科的病毒載 體。 本申請的專利技術人發現，通過使病毒載體的結構基因與抗原蛋白質或肽的基因以融 合的方式表達，能夠高效且定量地將抗原蛋白質或肽運送至靶細胞。 此外，專利技術人成功構建了以下4種類型的載體：類型1)，將抗原基因配置于膜蛋白 質HN基因的3'末端側（以下記作編碼鏈），由此以使得抗原處于在載體被膜的外部的形式 使抗原肽表達；類型2)，將抗原基因配置于F包裝細胞的F基因的3'末端側，由此使得抗 原肽在載體被膜的內部表達；類型3)，組合上述1)和2)，由此使得抗原肽在載體被膜的內 部和外部兩處均表達；以及類型4)，將抗原與作為向病毒的包裝信號發揮作用的膜蛋白質 的膜?細胞內結構域融合，由此在載體上整合進抗原。由此，向多個抗原的載體中進行各種 各樣的導入成為可能。 即，本專利技術涉及能夠將抗原多肽高效地傳遞至靶細胞中的病毒載體，具體而言提 供如下所述的專利技術： 病毒載體，是在副粘病毒科病毒的基因中整合有編碼抗原多肽的基因的病毒 載體，在所述病毒載體中，所述抗原多肽以與病毒的結構蛋白質或它們的一部分融合的融 合蛋白質的形式表達。 如本文檔來自技高網...

【技術保護點】
病毒載體，是在副粘病毒科病毒的基因中整合有編碼抗原多肽的基因的病毒載體，在所述病毒載體中，所述抗原多肽以與病毒的結構蛋白質或它們的一部分融合的融合蛋白質的形式表達。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：福村正之，大塚順平，野阪哲哉，鶴留雅人，河野光雄，原健一郎，
申請(專利權)人：生物科莫公司，國立大學法人三重大學，
類型：發明
國別省市：日本;JP